人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)B細(xì)胞增殖和終末分化.pdf

1、課題一:人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)B細(xì)胞增殖和終末分化
　　 背景:間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)是一類(lèi)具有自我更新(self renewal)和多向分化潛能(multi-lineage differentiation)的成體干細(xì)胞。它來(lái)源廣泛，可從骨髓、脂肪、臍帶、臍血、胎盤(pán)等多種組織中分離得到，并且不同來(lái)源的MSCs都具有相似的免疫調(diào)節(jié)、造血支持和組織修復(fù)功能。目前MSCs對(duì)T淋巴細(xì)胞的免

2、疫抑制作用成為MSCs對(duì)于自身免疫性疾病臨床治療應(yīng)用的理論基礎(chǔ)，但是MSCs對(duì)B淋巴細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)仍需要進(jìn)一步的深入探討。
　　 目的:探討人臍帶來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)B淋巴細(xì)胞的增殖和終末分化的免疫調(diào)節(jié)并揭示其主要的作用機(jī)制。
　　 方法:(1)應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)臍帶來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞免疫表型以及胚胎干細(xì)胞的全能標(biāo)志物。(2)間充質(zhì)干細(xì)胞三系分化誘導(dǎo)培養(yǎng):定向誘導(dǎo)人臍帶來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞分化，

3、用油紅O染色、Von Kossa染色、番紅O染色觀測(cè)脂滴形成、鈣鹽沉積和膠原合成情況以鑒定人臍帶來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞的多向分化潛能。(3)體外建立人臍帶來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞和CD19+B淋巴細(xì)胞的共培養(yǎng)體系利用Brdu酶聯(lián)免疫吸附法(Brdu ELISA試驗(yàn))檢測(cè)B淋巴細(xì)胞的增殖情況，并且用流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)B淋巴細(xì)胞的終末分化標(biāo)志CD138的表達(dá)情況;利用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒檢測(cè)B淋巴細(xì)胞IgM、IgA、IgG的分泌水平，從而反映人臍帶來(lái)

4、源的間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)活化后的B淋巴細(xì)胞的增殖和終末分化影響。(4)用transwe(ll)24孔培養(yǎng)板培養(yǎng)人臍帶來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞和CD19+T淋巴細(xì)胞以研究人臍帶來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)揮免疫抑制作用是否需要細(xì)胞直接接觸。(5)利用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒檢測(cè)共培養(yǎng)體系中PGE2和IL-6的分泌水平，并在共培養(yǎng)體系中加入PGE2合成酶的抑制劑吲哚美辛以及IL-6中和抗體，檢測(cè)其增殖和IgM、IgA、IgG分泌情況以驗(yàn)證其主要的介導(dǎo)因子。(6)將6

5、-8周BALB/c分為8組，分別標(biāo)記A-H，其中A和D注射T細(xì)胞依賴(lài)性抗原Ⅰ(TNP-Ficoll)、B和E組注射T細(xì)胞依賴(lài)性抗原Ⅱ(TNP-KLH)、C和F組注射T細(xì)胞非依賴(lài)型抗原(TNP-LPS)，小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)至3代，A、C、E、G組注射1*106/支小鼠骨髓MSC，B、D、F組注射PBS，H組為陰性對(duì)照組。7天后收集血清并檢測(cè)其IgM的分泌水平，14天后再次收集血清并檢測(cè)其IgG的分泌水平。對(duì)比小鼠骨髓MSC對(duì)體內(nèi)免疫

6、球蛋白分泌的影響。
　　 結(jié)果:(1)人臍帶MSCs表達(dá)CD13、CD29、CD49e、CD44、CD90、CD105、CD166和HLA-ABC(HLA-Ⅰ);均不表達(dá)造血細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志CD3、CD11b、CD14、CD19、CD31、CD34、CD45、CD80、CD86、CD133和HLA-DR(HLA-Ⅱ)等;(2)人臍帶來(lái)源的MSCs具有向脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞和成軟骨三系分化的能力。(3)人臍帶MSCs促進(jìn)B細(xì)胞的增殖。(4

7、)人臍帶MSCs促進(jìn)B細(xì)胞的終末分化和免疫球蛋白分泌。(5)人臍帶MSCs對(duì)B細(xì)胞的作用是通過(guò)可溶性因子實(shí)現(xiàn)的，其中PGE2發(fā)揮重要的作用，但是IL-6未有明顯的作用。(6)人臍帶MSCs促進(jìn)體內(nèi)T細(xì)胞依賴(lài)性抗體和非依賴(lài)型抗體的產(chǎn)生。
　　 結(jié)論:人臍帶來(lái)源MSCs促進(jìn)B細(xì)胞的增殖和終末分化作用，并且MSCs是通過(guò)分泌可溶性細(xì)胞因子PGE2而非IL-6發(fā)揮著促進(jìn)作用的。
　　 課題二:人臍帶來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞免疫活性檢測(cè)<

8、br>　　 背景:間充質(zhì)干細(xì)胞作為一種成體干細(xì)胞，其最初對(duì)MSCs的研究主要關(guān)注于其向多種組織細(xì)胞類(lèi)型分化的可塑性和再生能力，但是目前更多的關(guān)注集中到MSCs免疫調(diào)節(jié)功能，且目前研究比較清楚的是對(duì)外周血單個(gè)核細(xì)胞尤其是TH1型細(xì)胞因子分泌的免疫抑制作用。雖然目前的間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制并不非常清楚，但是越來(lái)越多的研究表明間充質(zhì)干細(xì)胞是通過(guò)可溶性細(xì)胞因子來(lái)實(shí)現(xiàn)的。故間充質(zhì)干細(xì)胞是目前治療一些免疫性疾病尤其是自身免疫性疾病的理想細(xì)胞，

9、但是由于不同組織來(lái)源甚至不同個(gè)體來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞其免疫學(xué)活性并不完全相同，目前缺乏對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞免疫學(xué)活性檢測(cè)的定量方法，而使的間充質(zhì)干細(xì)胞的臨床應(yīng)用過(guò)于凌亂，缺乏統(tǒng)一性的標(biāo)準(zhǔn)。
　　 目的:探討尋找定量檢測(cè)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞免疫學(xué)活性的定量的方法，為臨床的量化應(yīng)用打下基礎(chǔ)。
　　 方法:(1))體外檢測(cè)人臍帶來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞和健康成人外周血單個(gè)核細(xì)胞的共培養(yǎng)體系，利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒檢測(cè)其IFN-(γ)的分泌水

10、平，而反映人臍帶來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)活化后的外周血單個(gè)核細(xì)胞免疫抑制作用。將2×105hUC-MSCs接種于6孔板，2h貼壁后換液，加或不加IL-1β培養(yǎng)一段時(shí)間后，收集上清。采用酶聯(lián)免疫吸附法對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞PGE2的分泌進(jìn)行定量檢測(cè)。(2)建立不同濃度外源性PGE2和活化的健康成人外周血單個(gè)核細(xì)胞的培養(yǎng)體系，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)不同濃度外源性PGE2對(duì)外周血單個(gè)核細(xì)胞IFN-(γ)分泌進(jìn)行檢測(cè)，確定外源性PGE2對(duì)外周血單個(gè)核細(xì)胞I

11、FN-(γ)分泌的抑制曲線(xiàn)。(3)將收集的上述臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清50μL加入150μL成人外周血單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)體系中，培養(yǎng)3天后收集上清， ELISA檢測(cè)IFN-(γ)的分泌。
　　 結(jié)果:(1)人臍帶來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞能夠抑制活化的外周血單個(gè)核細(xì)胞IFN-(γ)的分泌，并且主要是通過(guò)分泌PGE2來(lái)實(shí)現(xiàn)的。(2)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在24小時(shí)時(shí)PGE2的分泌量最大，以后隨時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸下降。不同個(gè)體來(lái)源的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分泌

12、PGE2差別很大。(2)外源性PGE2以劑量依賴(lài)性抑制外周血單個(gè)核細(xì)胞IFN-(γ)的分泌，在1ng/mL-50ng/mL的濃度范圍內(nèi)變化最為明顯。(3)人臍帶來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞上清中PGE2在與外源性PGE2相同的濃度范圍內(nèi)能夠模擬外源性PGE2對(duì)外周血單個(gè)核細(xì)胞IFN-(γ)分泌的抑制作用，并且不同個(gè)體來(lái)源的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)IFN-(γ)分泌的抑制能力不同。
　　 結(jié)論:不同個(gè)體來(lái)源臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)能力不同，我們將

13、5×105臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在6孔板、2mL的培養(yǎng)體系中培養(yǎng)24小時(shí)后其上清中能否分泌20ng/mL的PGE2量定為臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞免疫強(qiáng)弱的臨界點(diǎn)，≥20ng/mL其免疫能力強(qiáng)，＜20ng/mL其免疫能力弱。
　　 課題三:IL-1β對(duì)人臍帶來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞造血支持的促進(jìn)作用
　　 背景:骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs）作為骨髓造血微環(huán)境中重要的組成

14、細(xì)胞是眾多造血微環(huán)境細(xì)胞的前體細(xì)胞，其對(duì)造血干細(xì)胞的增殖分化起重要的支持作用。但是，成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞存在來(lái)源有限、取樣時(shí)要進(jìn)行侵襲性操作以及間充質(zhì)干細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量和增殖分化能力會(huì)隨著供者年齡增加而下降等不足而限制了其廣泛應(yīng)用。研究表明其他來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞同樣具有造血支持作用，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源廣泛、無(wú)倫理學(xué)限制、更強(qiáng)的增殖能力、長(zhǎng)期培養(yǎng)和傳代后仍然維持干細(xì)胞特性而成為細(xì)胞治療中一種非常有希望的替代性干細(xì)胞，但是其造血支持能力仍有限

15、，因此尋找加強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞造血支持的方法成為MSC用于造血支持細(xì)胞治療的必要。
　　 目的:本研究旨在探討IL-1β對(duì)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hUC-MSCs)的及造血支持的影響。
　　 方法:將分離得到的hUC-MSCs(human umbilical cord mesenchymal stem cells)以2×106接種于75cm2培養(yǎng)瓶中，貼壁2小時(shí)后，加入10ng/mL IL-1β(interleukin1β)培養(yǎng)

16、36小時(shí)后收集培養(yǎng)上清和細(xì)胞。觀察有/無(wú)IL-1β的條件培養(yǎng)基對(duì)CD34+細(xì)胞粒系集落形成單位(Colony-Forming Unit-Granulocyte，CFU-G)、巨噬系集落形成單位(Colony-Forming Unit-Macrophage CFU-M)和粒-巨噬集落形成單位(Colony-Forming Unit-Granulocyte Macrophage，CFU-GM)、紅系爆式集落形成單位(Burst Formin

17、g Unit-Erythroid，BFU-E)、紅系集落形成單位（Colony-FormingUnit-Erythroid CFU-E）和粒紅單巨核集落形成單位(Colony-Forming Unit-Granulocyte/Erythroid/Macrophage/Monocyte CFU-GEMM)的集落形成能力的影響;實(shí)時(shí)定量PCR(real time PCR)檢測(cè)加/不加IL-1β hUC-MSCs的造血相關(guān)因子G-CSF、GM

18、-CSF、M-CSF、IL-6、SOD2、CDK6、TRIM22 mRAN的變化;酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)造血相關(guān)因子GM-CSF、M-CSF、IL-6蛋白濃度的差異。
　　 結(jié)果:①含有IL-1β的hUC-MSCs條件培養(yǎng)基能明顯增強(qiáng)CD34+細(xì)胞集落形成能力，且以粒系和粒-單核集落形成單位為主;②IL-1β促進(jìn)hUC-MSCs GM-CSF、G-CSF、IL-6的mRNA的表達(dá);③IL-1β促進(jìn)hUC-MSCs G