ATP水解酶對實驗性矽肺小鼠的干預研究.pdf

1、目的：矽肺是由長期慢性吸入二氧化硅（silicondioxide，SiO2）粉塵引起的職業(yè)性肺疾病。由于起病隱匿、持續(xù)進展且沒有有效的治療手段，矽肺已經(jīng)成為威脅發(fā)展中國家、特別是我國相關從業(yè)人員健康的非常嚴重的公共衛(wèi)生問題。目前普遍認為，肺部巨噬細胞可以吞噬SiO2顆粒，釋放一系列的炎癥介質(zhì)，在矽肺的發(fā)生發(fā)展過程發(fā)揮著重要的作用。而巨噬細胞具有異質(zhì)性，本課題組前期研究表明，干預巨噬細胞表型偏移可以減輕矽肺早期炎癥及晚期的纖維化表現(xiàn)。而胞

2、外三磷酸腺苷（extracellularadenosinetriphosphate，eATP）作為機體各個系統(tǒng)細胞之間信息交流的重要分子和內(nèi)環(huán)境的重要組成部分，可以影響巨噬細胞的表型極化。使用三磷酸腺苷雙磷酸酶（apyrase，Apy）降解呼吸道ATP能否減輕矽肺小鼠的炎癥和纖維化尚未明確。因此，本研究做出假設：使用Apy局部耗竭eATP可以通過調(diào)節(jié)單核巨噬細胞表型偏移，對矽肺的炎癥和纖維化起到干預作用。
　　方法：
　　1

3、、200只雄性C57BL/6J小鼠，隨機分為矽肺造模組（silica組），生理鹽水組（NS組），矽肺造模+溶劑對照組（Silica+NS組）及矽肺造模+Apy組（Silica+Apy），每組均為50只。2％異氟烷輕度麻醉小鼠后，silica組經(jīng)口咽吸入SiO2懸濁液建立小鼠矽肺模型，NS組給予等體積生理鹽水；Silica+Apy組在造模同時給予0.8μL0.5mg/mLApy，并在造模后4h重復給藥一次，Silica+NS組給予等量的生

4、理鹽水。造模后3h、7d、14d、28d、56d按標準方法取材。灌洗組小鼠進行經(jīng)氣管肺泡灌洗，取肺泡灌洗液（BronchoalveolarLavageFluid，BALF）進行灌洗液細胞計數(shù)、細胞分類計數(shù)及相關細胞因子的ELISA檢測，用流式細胞術檢測外周血單核細胞、肺泡巨噬細胞、肺間質(zhì)巨噬細胞表型；對非灌洗組右上肺進行病理學檢測，分別進行HE染色，苦味酸-天狼星紅染色，α-SMA、NLRP3+F4/80免疫熒光染色，左肺提取總RNA，

5、進行IL-1β、CCL2、NLRP3、COLⅠ、COLⅢ表達量檢測，右下中肺進行ATP含量檢測。
　　2、取5只雄性C57BL/6J小鼠，頜下靜脈叢取外周靜脈血，分選流式分選出外周血單核細胞；小鼠經(jīng)2%異氟烷麻醉后進行經(jīng)氣管肺泡灌洗，將肺泡灌洗液細胞及外周血單核細胞進行甩片、固定及破膜后進行P2X7R免疫熒光染色。
　　結果：
　　1、肺組織ATP檢測表明，矽肺造模后肺組織ATP水平明顯升高，給予Apy治療后可以顯著減

6、低肺組織ATP的含量，達到局部耗竭ATP的目的。
　　2、7d肺組織HE染色及相應的炎癥評分表明，與NS組相比，Silica組小鼠肺組織表現(xiàn)為大量炎癥細胞浸潤，肺泡間隔增寬、破壞及炎癥評分增高。BALF細胞計數(shù)表明，Silica組炎癥細胞的總數(shù)、巨噬細胞、中性粒細胞數(shù)均顯著升高，BALF上清IL-1β、CCL2蛋白水平及肺組織IL-1β、CCL2、NLRP3基因水平的表達量均顯著增高，肺組織NLRP3+F4/80免疫熒光染色表明，

7、矽肺小鼠肺組織NLRP3陽性巨噬細胞明顯增多。而Silica+Apy組與Silica+NS組相比，肺組織炎癥表現(xiàn)、炎癥細胞的浸潤明顯緩解，IL-1β、CCL2、NLRP3基因蛋白水平的表達均下降。
　　3、28d肺組織苦味酸-天狼星紅染色表明，Silica組小鼠肺組織在暗場可以觀察到大量的粗大的紅色膠原及細小的黃綠色膠原，基于苦味酸-天狼星紅染色的半定量分析表明矽肺組膠原容積分數(shù)顯著升高，肺組織α-SMA免疫熒光染色表明矽肺組α-

8、SMA陽性細胞百分數(shù)顯著增高，肺組織COLⅠ、COLⅢ的表達量增高；而Silica+Apy組與Silica+NS組相比，肺組織紅色及黃綠色膠原區(qū)域、膠原容積分數(shù)、α-SMA陽性細胞百分數(shù)顯著下降，COLⅠ、COLⅢ基因水平的表達量明顯下調(diào)。
　　4、7d、14d造模后，相對于NS組，Silica組小鼠外周血單核細胞Ly6Chi亞群比例顯著提高，肺泡巨噬細胞、肺間質(zhì)巨噬細胞M2表型比例增高，而Apy干預可以顯著逆轉(zhuǎn)矽肺造模導致的上述