建立在豬骨骼肌差異表達(dá)EST基礎(chǔ)上的新基因cDNA克隆及其功能研究.pdf

1、近年來(lái),豬骨骼肌轉(zhuǎn)錄譜的研究取得了較大進(jìn)展,獲得了大量差異表達(dá)EST,但是,如何建立這些差異表達(dá)EST與經(jīng)濟(jì)性狀表型差異的聯(lián)系,并利用這些序列信息實(shí)現(xiàn)對(duì)農(nóng)業(yè)動(dòng)物經(jīng)濟(jì)性狀的改良則是今后很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)需要解決的重大課題。而首先需要解決的一個(gè)問(wèn)題就是通過(guò)EST克隆獲得相應(yīng)基因的cDNA信息,并研究基因的功能和相互調(diào)控關(guān)系。
　　 本研究以本實(shí)驗(yàn)室前期轉(zhuǎn)錄組研究發(fā)現(xiàn)的三條豬背最長(zhǎng)肌組織中差異表達(dá)EST為基礎(chǔ),開(kāi)展了候選基因的克隆、定位及

2、其功能研究工作,得到如下結(jié)果:
　　 1.以差異表達(dá)EST為基礎(chǔ),結(jié)合生物信息學(xué)與實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證克隆獲得了豬PPP2R5A、CSRP1和CSRP2基因包含完整CDS的cDNA序列以及CSRP3基因和LDB1基因的全長(zhǎng)cDNA序列。
　　 2.利用SCHP和RH克隆板對(duì)上述5個(gè)基因及PP2A相關(guān)的另6個(gè)基因共11個(gè)基因進(jìn)行了染色體定位,結(jié)果如下:PPP2CA定位于SSC2q21-qter,PPP2CB定位于SSC15q,PPP2

3、R1A定位于SSC6q12-q21,PPP2R1B定位于SSC9p21,PPP2R5A定位于SSC9q26,PPP2R5B定位于SSC2p14-p17,PPP2R5D定位于SSC7q11-q12,CSRP1基因定位于SSC10,CSRF2基因定位于SSC5,CSRP3基因定位于SSC2p14-p17,LDB1基因定位于SSC14。
　　 3.利用QPCR發(fā)現(xiàn)豬PPP2R5A基因在心、肝、脾、肺、腎、肌肉、脂肪、小腸組織中廣泛表達(dá)

4、,但在肌肉組織中表達(dá)量明顯高于其他組織,并在脂肪組織中高表達(dá)；同時(shí)發(fā)現(xiàn)該基因在通城豬和長(zhǎng)白豬胎兒背最長(zhǎng)肌中呈上調(diào)表達(dá)趨勢(shì),且在33天和65天,兩品種間表達(dá)差異顯著。
　　 4.通過(guò)RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)CSRP1基因和CSRP2基因均呈廣泛表達(dá)特征,而CSRP3基因僅在橫紋肌中表達(dá),定量PCR顯示該基因在通城和長(zhǎng)白豬肌肉發(fā)育過(guò)程中上調(diào)表達(dá),但是兩品種間基因表達(dá)差異不顯著；推導(dǎo)了豬CSRP家族三個(gè)基因的氨基酸序列,構(gòu)建了該家族基因的

5、系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),并結(jié)合氨基酸同源性推測(cè)此家族三個(gè)基因具有共同的祖先,CSRP1基因與CSRP2基因在結(jié)構(gòu)、功能和進(jìn)化關(guān)系上更為接近,而CSRP3基因則相對(duì)獨(dú)立。
　　 5.克隆獲得了豬CSRP3基因6293bp的DNA序列,推測(cè)了該基因的基因組結(jié)構(gòu)以及剪接位點(diǎn)信息；并克隆了該基因部分啟動(dòng)子序列,預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)存在典型的“TATA”Box和E-Box,并包含MEF2、RAR-beta及HNF3-like等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)；發(fā)現(xiàn)了豬CSRP3

6、基因的13個(gè)潛在SNP位點(diǎn),并發(fā)現(xiàn)可能存在兩種較為穩(wěn)定的單倍型,進(jìn)一步利用TaqI PCR-RFLP方法對(duì)C466T多念位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn),該位點(diǎn)不同基因型頻率在國(guó)內(nèi)外品種之間存在顯著差異。
　　 6.發(fā)現(xiàn)豬LDB1基因5’UTR、3’UTR及CDS區(qū)中均存在選擇性剪接。其中位于CDS區(qū)中的一個(gè)選擇性剪接造成其編碼蛋白缺少了46個(gè)氨基酸,并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)這種選擇性剪接體在肺臟中具有較高表達(dá),其次在肌肉組織中可檢測(cè)到表達(dá)；成功構(gòu)建了該基因兩

7、種轉(zhuǎn)錄本的pEGFP-N1融合表達(dá)載體,通過(guò)轉(zhuǎn)染并利用激光共聚焦觀察發(fā)現(xiàn)兩種轉(zhuǎn)錄本均呈現(xiàn)“核質(zhì)”共定位特征。
　　 7.成功克隆了豬LDB1基因上游約2.6kb的啟動(dòng)子序列,并構(gòu)建了11個(gè)pGL3報(bào)告基因載體,轉(zhuǎn)染豬IBRS-2腎細(xì)胞,通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)了對(duì)于該基因轉(zhuǎn)錄活性起重要調(diào)節(jié)作用的三個(gè)保守區(qū)域,通過(guò)分析推測(cè)SP1、NF-KappaB等轉(zhuǎn)錄因子可能參與LDB1基因的轉(zhuǎn)錄激活,而ARP-1和TtK等轉(zhuǎn)錄因子可