抗人乙酰膽堿受體單鏈抗體1956#的可溶性表達(dá)、純化及其功能鑒定.pdf

1、重癥肌無力（MG）是由乙酰膽堿受體抗體(AChRAbs)介導(dǎo)，補(bǔ)體參與的自身免疫性疾病，由于其抗原、抗體明確且免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制也相對(duì)清楚，對(duì)研究其他自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制和治療具有指導(dǎo)意義。抗人AChR的單鏈抗體（scFv）是單價(jià)抗體并且缺乏Fc段，不會(huì)引起抗原調(diào)變作用或激活補(bǔ)體破壞突觸后膜，可以保護(hù)NMJ突觸后膜的AChR免受MG患者血清中自身抗體的攻擊，成為MG治療最有潛力的靶點(diǎn)。
　　以往scFv的可溶性表達(dá)多采用載體pHE

2、N1，以帶信號(hào)肽PelB的分泌型表達(dá)形式進(jìn)行。盡管可以直接在胞周質(zhì)或培養(yǎng)上清中得到可溶性scFv，然而這種方式存在可溶性蛋白產(chǎn)量低，純化過程代價(jià)高的缺陷，給大量制備帶來困難。本研究擬采用融合NusA標(biāo)簽蛋白的方式表達(dá)scFv1956＃，以期得到大量可溶性的表達(dá)產(chǎn)物。
　　用PCR擴(kuò)增含有抗人AChRscFv1956＃的載體pHEN1中scFv1956＃的結(jié)構(gòu)基因，并將其插入到原核表達(dá)載體pET44a(+)中。用重新構(gòu)建的載體pET

3、44a(+)-scFv1956＃轉(zhuǎn)化菌株BL21(DE3)pLysS和Roseta-garmiB(DE3)；同時(shí)用原有載體pHEN1-scFv1956＃轉(zhuǎn)化菌株HB2151和JM109，分別用兩種誘導(dǎo)條件誘導(dǎo)表達(dá)：標(biāo)準(zhǔn)的1mMIPTG，37℃誘導(dǎo)4h；低溫25℃長(zhǎng)時(shí)間誘導(dǎo)20h。用SDS-PAGE來比較不同載體和菌株在不同溫度和時(shí)間的誘導(dǎo)條件下scFv1956＃可溶性表達(dá)的量，并通過Westernblot進(jìn)行鑒定。
　　結(jié)果顯示P

4、CR產(chǎn)物大小為785bp，與預(yù)計(jì)相符；所構(gòu)建質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序證實(shí)scFv1956＃核苷酸序列正確，并正確插入載體pET44a(+)。SDS-PAGE和Westernblot的結(jié)果顯示，新構(gòu)建的載體pET44a(+)-scFv1956＃在不同菌株和誘導(dǎo)條件下所得到的可溶性蛋白表達(dá)量均優(yōu)于原載體pHEN1-scFv1956＃。對(duì)于載體pHEN1-scFv1956＃，換不同菌株表達(dá)或采用低溫長(zhǎng)時(shí)間的誘導(dǎo)方式均不能提高胞周質(zhì)或培養(yǎng)上清中可溶性蛋白的含

5、量；而對(duì)于載體pET44a(+)-scFv1956＃，低溫長(zhǎng)時(shí)間誘導(dǎo)確實(shí)有助于提高可溶性表達(dá)的量，而且用菌株BL21(DE3)pLysS表達(dá)時(shí)這種趨勢(shì)更為明顯。
　　用菌株BL21(DE3)pLysS表達(dá)pET44a(+)-scFv1956＃，1mMIPTG，25℃誘導(dǎo)20h，裂菌后的可溶性成分經(jīng)Ni2+親和層析柱純化，并用凝血酶（Thrombin）切除融合蛋白上的NusA標(biāo)簽。Westernblot的結(jié)果證實(shí)酶切后相對(duì)分子量為2