可溶性全長(zhǎng)hPPARγ重組蛋白的制備及其活性研究.pdf

1、PPARγ(peroxisome proliferator activatived receptorγ，過氧化物酶體增殖物激活受體)是核激素受體超家族中的非常重要成員之一，除在脂肪組織中高表達(dá)外，在肺、結(jié)腸、乳腺、卵巢等組織也有不同程度的高表達(dá)。PPARγ既可參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)脂肪代謝和糖代謝，又可抑制腫瘤細(xì)胞增殖、分化以及促進(jìn)細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)運(yùn)等。因此，PPARγ是腫瘤細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的重要靶點(diǎn)蛋白，現(xiàn)已成為熱點(diǎn)研究的核受體之一。外源性制備

2、hPPARγ重組蛋白(Human Peroxisome proliferator-activated receptorγ)，能夠?yàn)槠湎嚓P(guān)分子靶向藥物的篩選打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。為此，本文擬制備可溶性全長(zhǎng)hPPARγ重組蛋白，并對(duì)其活性進(jìn)行研究，其主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下：
　　1.采用帶有六個(gè)組氨酸[His]6的泛素化小修飾蛋白(SUMO)為融合表達(dá)標(biāo)簽，設(shè)計(jì)并構(gòu)建可溶性全長(zhǎng)hPPARγ重組蛋白的表達(dá)質(zhì)粒pReceiver-B13-SUM

3、O-hPPARγ，經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，細(xì)菌培養(yǎng)，在優(yōu)化條件(16℃、IPTG濃度0.5 mM、誘導(dǎo)時(shí)間20 h)下，表達(dá)出可溶性全長(zhǎng)[His]6-SUMO-hPPARγ重組蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，與hPPARγ蛋白的理論分子量(67.2 kDa，包括[His]6-SUMO)是一致的。
　　2.采用Ni2+親和色譜柱于變性條件下一步純化目標(biāo)蛋白，優(yōu)化純化條件，可獲得純度為90％的全長(zhǎng)[His]6-SUMO-hPPARγ變性重組蛋白

4、。變性目標(biāo)蛋白經(jīng)透析復(fù)性后，能獲得可溶性全長(zhǎng)[His]6-SUMO-hPPARγ重組蛋白。
　　3.利用DEAE-52陰離子交換樹脂在非變性條件下一步純化目標(biāo)蛋白，用NaCl溶液梯度洗脫目標(biāo)蛋白，從每升LB培養(yǎng)介質(zhì)中可獲得135mg、純度為80％的可溶性全長(zhǎng)[His]6-SUMO-hPPARγ重組蛋白。
　　4.采用分子排阻色譜，高效液相色譜法(size exclusion chromato-graphy-high perf

5、ormance chromatography，SEC-HPLC)，測(cè)定了全長(zhǎng)[His]6-SUMO-hPPARγ重組蛋白與Ros(Rosiglitazone，羅格列酮)配體結(jié)合活性，其Kd值為492 nM，結(jié)合率約為70％。
　　綜上所述，本文建立以帶有[His]6組氨酸的泛素化小修飾蛋白為融合表達(dá)標(biāo)簽的質(zhì)粒、重組表達(dá)、純化得到具有生物學(xué)活性的可溶性全長(zhǎng)[His]6-SUMO-hPPARγ重組蛋白的制備方法，采用DEAE-52陰離