CD226+NK細(xì)胞參與系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病進(jìn)程.pdf

1、自然殺傷細(xì)胞(Nature Killer cell，NK 細(xì)胞)最初被稱為大顆粒淋巴細(xì)胞，其表面表達(dá)多種不同于T 細(xì)胞抗原受體(TCR)與B 細(xì)胞抗原受體(BCR)的非抗原特異性受體，因不需要抗原存在或預(yù)先致敏就能夠識別并殺傷一些腫瘤細(xì)胞而得名。作為固有免疫系統(tǒng)中的重要一員，NK 細(xì)胞在機(jī)體抵御外界感染，防止體內(nèi)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化等方面發(fā)揮著重要的作用。此外，NK 細(xì)胞還能通過分泌多種細(xì)胞因子和趨化因子，如IFN-γ、TNF-α/β、IL-2

2、、IL-10、IL-13、CCL2(MCP-1)、CCL3(MIP1-a)、CCL4(MIP1-b)、CCL5(RANTES)、XCL1(lymphotactin)和CXCL8(IL-8)等，以及通過細(xì)胞間的接觸在免疫調(diào)節(jié)中扮演重要角色。NK 細(xì)胞與病毒感染和癌癥之間的關(guān)系一直是免疫學(xué)研究的熱點領(lǐng)域，近年來更有研究發(fā)現(xiàn)NK 細(xì)胞在糖尿病，腦脊髓炎，多發(fā)性硬化癥，系統(tǒng)性紅斑狼瘡等多種自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展中扮演了保護(hù)機(jī)體或促進(jìn)疾病的復(fù)雜

3、的雙重角色。
　　 系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic Lupus Erythematosus，SLE)是一種慢性的能引起機(jī)體多種臟器病變的自身免疫性疾病，多發(fā)病于女性，尤其是育齡期的女性。盡管目前對SLE 發(fā)病機(jī)制的研究得到較大的發(fā)展，但其成果主要集中在疾病與適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的關(guān)系上，而固有免疫系統(tǒng)特別是NK 細(xì)胞對疾病的影響目前尚不清楚。越來越多的證據(jù)表明，固有免疫系統(tǒng)在自身免疫病的發(fā)生發(fā)展過程中起到了重要作用。對于大多數(shù)自身免

4、疫病患者來說，固有免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)之間的相互作用可能是一個較長的過程，在疾病靜息期很難被發(fā)現(xiàn)，固有免疫系統(tǒng)在疾病早期發(fā)揮的作用也可能因此被忽視。
　　 基于上述幾點考慮，本研究目的在于研究NK 細(xì)胞在SLE 疾病進(jìn)展中的作用機(jī)制，重點探討了SLE 患者外周中NK 細(xì)胞數(shù)量顯著降低的原因，并比較了外周循環(huán)和局部組織中的NK 細(xì)胞的功能差異，以期為尋找更好的SLE 臨床診斷和治療方案提供線索。
　　 在本實驗中，我們

5、收集SLE 患者的外周血標(biāo)本，根據(jù)疾病狀態(tài)并按照SLEDAI(SLE Disease Activity Index)評分標(biāo)準(zhǔn)將患者分為活動期(SLEDAI≧4分)和緩解期(SLEDAI﹤4分)兩組，以健康成年人的外周血作為對照。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測不同淋巴細(xì)胞群體的表型，分析各種細(xì)胞所占比例，再結(jié)合細(xì)胞計數(shù)算出這些細(xì)胞群體的具體數(shù)量；同時采用流式細(xì)胞術(shù)檢測NK 細(xì)胞表面多種活化性及抑制性受體的表達(dá)情況；用密度梯度離心的方法分離出外周血中的

6、單個核淋巴細(xì)胞，再利用MACS 磁珠分離方法純化出特定的細(xì)胞亞群，分別加入細(xì)胞因子或SLE 病人血漿進(jìn)行體外培養(yǎng)；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞在不同刺激因素作用下的狀態(tài)變化；利用Annexin V和PI染色分析體外培養(yǎng)的細(xì)胞亞群在刺激因素作用下的凋亡情況；利用ELISA 方法檢測血漿中特定細(xì)胞因子的表達(dá)水平，用胞內(nèi)細(xì)胞因子染色技術(shù)檢測細(xì)胞分泌特定細(xì)胞因子的能力；利用熒光定量PCR 技術(shù)檢測干擾素誘導(dǎo)基因的表達(dá)情況；采用H&E染色方法觀察組織病理損

7、傷狀況。
　　 通過上述研究方法，我們獲得了以下結(jié)果以及結(jié)論：
　　 1.活動期SLE 患者外周循環(huán)中CD226+NK 細(xì)胞的比例明顯降低首先我們對SLE 患者外周血中CD4+T、CD8+T、B、NK、NKT、MDC和PdC細(xì)胞的比例進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)活動期狼瘡患者NK和NKT 細(xì)胞的比例顯著低于正常對照和緩解期的狼瘡患者。再結(jié)合細(xì)胞計數(shù)算出單位毫升血中NK和NKT細(xì)胞的絕對數(shù)，發(fā)現(xiàn)活動期患者NK和NKT 細(xì)胞的絕對數(shù)也顯著

8、降低。分析NK細(xì)胞表面分子的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，活化性分子CD69、NKp46、NKG2C、NKG2D、CD16和抑制性分子NKG2A、CD94和 CD85j的表達(dá)在活動期患者和正常對照NK 細(xì)胞的表達(dá)沒有明顯差異，但是活化性CD226 受體的表達(dá)在活動期患者NK 細(xì)胞明顯降低。為了驗證這一現(xiàn)象，我們在小鼠模型中也進(jìn)行了CD226表達(dá)的檢測，同樣發(fā)現(xiàn)狼瘡發(fā)病小鼠脾臟中NK 細(xì)胞上CD226表達(dá)明顯低于對照鼠和發(fā)病早期的小鼠。
　　 綜上所

9、述，外周循環(huán)的NK 細(xì)胞比例和數(shù)量在活動期狼瘡患者體內(nèi)明顯降低，卻能在緩解期患者體內(nèi)基本恢復(fù)到正常水平，同時在活動期狼瘡患者體內(nèi)降低的NK 細(xì)胞主要是CD226+NK 細(xì)胞。
　　 2.CD226+NK 細(xì)胞在SLE 患者體內(nèi)隨疾病狀態(tài)的改變出現(xiàn)動態(tài)變化對15例臨床患者進(jìn)行治療期間的動態(tài)觀察，分別獲取藥物治療前以及治療期間不同天數(shù)的外周血，檢測NK 細(xì)胞比例和CD226分子在NK 細(xì)胞上表達(dá)變化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中有6例患者病情沒

10、有得到有效緩解，他們的NK 細(xì)胞比例和CD226分子的表達(dá)持續(xù)降低，與之相反的另外9例患者病情好轉(zhuǎn)，其NK 細(xì)胞比例和CD226分子的表達(dá)明顯恢復(fù)。
　　 綜上所述，CD226+NK 細(xì)胞的比例在狼瘡患者體內(nèi)隨病情狀態(tài)的改變而動態(tài)變化，說明CD226+NK 細(xì)胞可能參與了疾病的進(jìn)程。
　　 3.SLE 患者樹突狀細(xì)胞上表達(dá)CD226分子的配體CD112和CD155比較分析CD226的配體CD112和CD155 在T、B、

11、NK、MDC和PdC細(xì)胞上的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SLE 患者的PDCs上同時表達(dá)這兩種分子，并且表達(dá)量略高于正常對照。根據(jù)以上結(jié)果我們推測在SLE 患者體內(nèi)NK 細(xì)胞和PDCs 很可能通過CD226-CD112/CD155 這對受配體的識別而產(chǎn)生相互作用，參與狼瘡的發(fā)病過程。
　　 4.IFN-α誘導(dǎo)CD226+NK 細(xì)胞發(fā)生活化后凋亡首先利用ELISA的方法檢測患者血漿中IFN-?，IFN-?，IL-2和 IL-12等細(xì)胞因子的含量

12、，結(jié)果只檢測出IFN-?的水平明顯升高。隨后對5例患者的血漿進(jìn)行連續(xù)動態(tài)觀察，發(fā)現(xiàn)IFN-?的表達(dá)水平隨疾病緩解持續(xù)降低，病情穩(wěn)定后基本恢復(fù)至正常人水平。用患者血漿刺激正常人的外周血單個核細(xì)胞(PBMCs)，培養(yǎng)24小時后檢測干擾素誘導(dǎo)基因(IFIGs)表達(dá)，通過與阻斷IFN-?
　　 的對照組相比較發(fā)現(xiàn)，患者體內(nèi)IFN-?能夠誘導(dǎo)正常細(xì)胞表達(dá)高水平IFIGs，說明這些IFN-?具有良好的生物學(xué)活性。流式結(jié)果顯示PDCs是SLE

13、 患者體內(nèi)IFN-?的主要來源細(xì)胞。利用體外rhIFN-? 或患者血漿培養(yǎng)正常人PBMCs 發(fā)現(xiàn)，CD226+NK 細(xì)胞能被誘導(dǎo)高表達(dá)CD69，而CD226-NK 細(xì)胞活化不明顯。同時，伴隨活化的過程，NK 細(xì)胞出現(xiàn)明顯的CD226表達(dá)降低及活化誘導(dǎo)的凋亡發(fā)生。
　　 綜上所述，在活動期狼瘡患者體內(nèi)PDCs 持續(xù)產(chǎn)生IFN-? 使IFN-? 水平升高，而這些IFN-α能夠刺激NK 細(xì)胞發(fā)生活化誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，并且主要影響的是CD

14、226+NK 細(xì)胞，最終導(dǎo)致患者外周中整體NK 細(xì)胞數(shù)量降低。
　　 5.活化的CD226+NK 細(xì)胞介導(dǎo)MRL/lpr小鼠腎臟損傷參與SLE 疾病進(jìn)展將MRL/lpr 狼瘡模型鼠分成發(fā)病早期和已發(fā)病兩組，以MRL/mp 鼠作為正常對照，分別研究小鼠脾臟和腎臟中NK 細(xì)胞比例和數(shù)量的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)病早期小鼠腎臟中有大量CD226+NK 細(xì)胞浸潤，并且浸潤的細(xì)胞明顯處于活化狀態(tài)。通過檢測胞內(nèi)細(xì)胞因子的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)腎臟浸潤的NK 細(xì)

15、胞比脾臟中的NK 細(xì)胞表達(dá)高水平的IFN-?、顆粒酶B和穿孔素。
　　 根據(jù)以上結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)在狼瘡疾病中，外周活化的CD226+NK 細(xì)胞在發(fā)生凋亡前會浸潤到腎臟等組織中，通過分泌IFN-?、細(xì)胞毒性顆粒等在一定程度上參與了組織的病理損傷。
　　 綜合以上，本研究得到如下結(jié)論：SLE 患者NK 細(xì)胞在體內(nèi)高水平IFN-?的作用下發(fā)生活化誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，導(dǎo)致外周NK 細(xì)胞的數(shù)量顯著降低，并且主要受影響的是CD226+N