芋螺毒素Ma6A與MaI126的生物法合成研究.pdf

1、芋螺(Conus)屬腹足綱軟體動(dòng)物,全球約500多種。芋螺毒素(Conotoxin,Conopeptide,CTX)是從芋螺中得到的一類(lèi)具有生物活性的多肽毒素。最近研究表明,每種芋螺可能含有1000-1900種芋螺毒素,即全世界大約有＞500000種芋螺毒素,大大超過(guò)了以前認(rèn)為有約5萬(wàn)種芋螺毒素的認(rèn)識(shí)。芋螺毒素通常是由8～40個(gè)氨基酸殘基組成,富含二硫鍵,化學(xué)結(jié)構(gòu)新穎,生物活性強(qiáng),作用靶位的選擇性高,目前發(fā)現(xiàn)的芋螺毒素超家族主要有A-,

2、T-,O-,M-,P-,I-和S-超家族等。它們已在神經(jīng)科學(xué)研究領(lǐng)域和新藥研制方面受到了前所未有的廣泛關(guān)注,因此對(duì)芋螺毒素進(jìn)行深入研究很有意義。由于天然芋螺毒素含量甚微,有關(guān)芋螺毒素的研發(fā)大多轉(zhuǎn)向人工化學(xué)合成,但其毒性大、產(chǎn)率小、純度低、成本很高,尤其是對(duì)于分子量較大的多肽,合成更為困難,合成的線性肽還要經(jīng)過(guò)氧化折疊等繁瑣的步驟才能獲得具有二硫鍵配對(duì)正確的生物活性肽。因此,大量芋螺毒素藥物寶庫(kù)的開(kāi)發(fā)僅靠化學(xué)合成還不能滿(mǎn)足作為藥物研究和商

3、業(yè)化生產(chǎn)的要求。已知芋螺毒素在體內(nèi)是由其前體基因經(jīng)表達(dá)和翻譯后修飾而獲得的直接產(chǎn)物,因而通過(guò)基因體外重組表達(dá),進(jìn)行生物法合成是大量獲得目的毒素肽的有效新途徑。
　　 本研究探索用生物法合成2個(gè)芋螺毒素Ma6A和MaI126,以期低成本大量獲得這2個(gè)毒素肽。芋螺毒素Ma6A和MaI126的基因均來(lái)自于大理石芋螺(Conus marmoreus),其中Ma6A是O-超家族基因,MaI126是一種新型T超家族芋螺毒素基因。Ma6A成熟

4、肽含有31個(gè)氨基酸,三對(duì)二硫鍵,具有阻斷鈉離子通道的生物活性;MaI126含有13個(gè)氨基酸,兩對(duì)二硫鍵。我們選用畢赤酵母真核生物表達(dá)系統(tǒng)來(lái)重組生產(chǎn)芋螺毒素Ma6A和MaI126,期望通過(guò)畢赤酵母細(xì)胞內(nèi)的翻譯后修飾系統(tǒng)對(duì)外源芋螺毒素Ma6A和MaI126基因進(jìn)行分泌表達(dá),所得的重組芋螺毒素在酵母細(xì)胞分泌表達(dá)過(guò)程中完成氧化折疊,直接將具有天然芋螺毒素構(gòu)象的重組多肽分泌到培養(yǎng)基中,通過(guò)進(jìn)一步分離純化,即可大量獲得目的芋螺毒素肽。
　　

5、 本研究通過(guò)設(shè)計(jì)Ma6A成熟肽的基因序列,利用酵母信號(hào)肽,與畢赤酵母表達(dá)載體pPICZαA相連,構(gòu)建了分別含有純化蛋白標(biāo)簽和不含純化蛋白標(biāo)簽的表達(dá)載體pPICZαA-Ma6Af與pPICZαA-Ma6An。實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建好的、含有MaI126基因的酵母表達(dá)載體pPICZA-MaI126,利用了芋螺毒素MaI126基因本身的信號(hào)肽。將上述構(gòu)建好的各種表達(dá)載體進(jìn)行線性化,并優(yōu)化電轉(zhuǎn)化條件,將3種表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)入畢赤酵母宿主菌中,經(jīng)Zeocin

6、抗生素篩選和PCR產(chǎn)物回收連接T-載體后,進(jìn)行測(cè)序鑒定,選取含有完整目的基因、且拷貝數(shù)高的重組子,利用甲醇進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)。
　　 在誘導(dǎo)過(guò)程中,探索和優(yōu)化了誘導(dǎo)表達(dá)條件、以及載體與宿主菌之間的相互匹配。結(jié)果表明,最佳誘導(dǎo)時(shí)間為72h,最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基選擇MM;通過(guò)比較3種不同酵母宿主菌(GS115、KM71、X-33)的誘導(dǎo)表達(dá)效果可知,芋螺毒素在宿主菌X-33中誘導(dǎo)表達(dá)效果較好,表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Tricine-SDS-PAGE電泳分析