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文檔簡介
1、深海環(huán)境通常具有高鹽,高壓,低溫,無光照等特點,其海底沉積物的微生物往往具有適應(yīng)特殊環(huán)境的獨特生理代謝機制和分子細胞結(jié)構(gòu)。其特定的生態(tài)環(huán)境蘊藏著獨特而又極其豐富的微生物資源,其中大部分還鮮為人知,為研究中度嗜鹽菌鹽適應(yīng)機制提供了新的材料。面對海洋環(huán)境中隨時存在的失去胞內(nèi)外滲透壓平衡的威脅,大部分微生物在長期的進化過程中形成了其獨特的應(yīng)對機制,其中最重要的就是大多數(shù)中度嗜鹽菌通過在胞內(nèi)積累相容性溶質(zhì)來調(diào)節(jié)滲透壓的變化并維持細胞正常的代謝活
2、動。由于這是一種非常靈活的短期或瞬變的反應(yīng),隨外界滲透壓的變化而變化,它成為目前微生物滲透壓研究的模型和熱點。
在文庫篩選過程中發(fā)現(xiàn)一株在6%NaCl濃度LB培養(yǎng)基中生長良好的克隆子FOS36K,在分析FOS36K的外源片段酶切圖譜的基礎(chǔ)上,選用BamHⅠ和NheⅠ依次進行兩次亞克隆,將FOS36K質(zhì)粒外源片段大小從36K縮小至9K,獲得了一株同樣有耐鹽特性的亞克隆FOS9K。分析FOS9K外源片段序列,含有六個ORF,推
3、測耐鹽特性的產(chǎn)生與其中ORF6(命名為putP-sea)單個基因的表達產(chǎn)物有關(guān)。putP-sea基因編碼產(chǎn)物為492個氨基酸,分子量約為53 kDa。通過互聯(lián)網(wǎng)對PutP-sea蛋白分別進行了氨基酸疏水性分析,發(fā)現(xiàn)PutP-sea蛋白存在11個疏水區(qū),說明PutP-sea蛋白是1個跨膜蛋白。將ORF6的序列在Genbank中用Blast軟件進行同源性比較,結(jié)果表明ORF6編碼的蛋白質(zhì)序列與Idiomarina balticaOS145來
4、源的Na+和脯氨酸轉(zhuǎn)運子(PutP)有82%的相似性。通過PCR的方法把包括整個putP-sea基因ORF框及可能的啟動子核苷酸序列在內(nèi)的2.2kb的片段克隆到pBR322載體上,構(gòu)建了重組質(zhì)粒pBRputP-sea,轉(zhuǎn)化E.coli EPI300后得到轉(zhuǎn)化子為EPI/pBRputP-sea,其耐鹽特性和原始克隆子FOS36K類似,為此本研究認為ORF6為耐鹽相關(guān)基因。
本研究使用了Red同源重組技術(shù),在E.coli EP
5、I300菌株中通過敲除染色體上的putP基因,構(gòu)建putP基因缺失的新菌株EPI-△putP。該菌株在含脯氨酸為單一碳源的M8基本培養(yǎng)基上不能生長,而將pBRputP-sea重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到EPI-△putP中,使該菌株在含脯氨酸為單一碳源的M8基本培養(yǎng)基上生長。說明putP-sea基因具有將外界脯氨酸轉(zhuǎn)運至胞內(nèi)的功能。在不同NaCl濃度的LB培養(yǎng)基中測定四種菌株胞內(nèi)自由脯氨酸含量,發(fā)現(xiàn)EPI/pBRputP-sea和EPI-△putP/
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