鹿瓜多肽對(duì)脊髓損傷修復(fù)的作用研究.pdf

1、脊髓損傷（SpinalCordInjury,SCI）后出現(xiàn)代謝紊亂、炎癥反應(yīng)、局部缺血、神經(jīng)元死亡等一系列繼發(fā)性損傷，加上中樞神經(jīng)自身再生能力有限，這些都成為脊髓損傷治療中難以克服的障礙。盡管脊髓的原發(fā)性損傷是不可逆轉(zhuǎn)的，但繼發(fā)性損傷卻是一個(gè)動(dòng)態(tài)調(diào)控、可被逆轉(zhuǎn)的過(guò)程，因此也為人們提供了有效時(shí)機(jī)來(lái)挽救受損神經(jīng)元，最大程度減輕SCI帶來(lái)的災(zāi)難性后果。發(fā)展神經(jīng)保護(hù)劑，通過(guò)藥物對(duì)繼發(fā)性損傷的不同病理過(guò)程進(jìn)行干預(yù)，盡可能保護(hù)受損的神經(jīng)元以及促進(jìn)受

2、損神經(jīng)元的再生是目前脊髓損傷治療的主要方向之一，選擇安全有效的治療藥物對(duì)SCI的預(yù)后起著至關(guān)重要的作用。
　　鹿瓜多肽（Cervusandcucumispolypeptide,CCP）是由梅花鹿的骨骼和干燥的甜瓜籽制成的一種中藥復(fù)合制劑，在臨床上被廣泛應(yīng)用于骨折、骨質(zhì)疏松、疼痛、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病的治療，療效顯著，無(wú)明顯不良反應(yīng)。其成分中包含著TGF-β，BMP，F(xiàn)GF等活性因子，它們參與了細(xì)胞的分化，緩解炎癥反應(yīng)，改善微循環(huán)以

3、及刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和促進(jìn)新生血管形成等諸多環(huán)節(jié)。脊髓損傷后出現(xiàn)的多種病理過(guò)程都能與鹿瓜多肽的治療靶點(diǎn)相匹配。因此我們?cè)O(shè)想：CCP是否可以用于脊髓損傷的治療以及該藥物的主要作用對(duì)象和影響的主要病理過(guò)程有哪些？為此我們?cè)O(shè)計(jì)了以下實(shí)驗(yàn)：
　　實(shí)驗(yàn)一：鹿瓜多肽對(duì)大鼠脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的作用
　　曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)：所有大鼠脊髓損傷模型采用中度脊髓夾傷模型。CCP治療后4d，BBB平均分值為12.6±0.86，明顯高于對(duì)照組（9.5±0

4、.83）（p<0.01）；此時(shí)大鼠已經(jīng)能夠持續(xù)負(fù)重行走，并伴有偶發(fā)的前后肢協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)。SCI后7d，CCP治療組大鼠后肢運(yùn)動(dòng)恢復(fù)的速度（16.7±0.87）顯著高于對(duì)照組（13.7±0.56）（p<0.05），動(dòng)物表現(xiàn)為持續(xù)的前后肢協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)。但在SCI后14d，動(dòng)物后肢運(yùn)動(dòng)恢復(fù)的程度在CCP處理組（18.0±0.56）和對(duì)照組(16.3±1.02)已無(wú)明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p>0.05）。
　　足跡實(shí)驗(yàn)：脊髓損傷后5d，對(duì)照組大鼠后肢T

5、oedragging高達(dá)34.6％，與CCP治療組（9.6％）相比，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.001)。至7d時(shí)，CCP組Toedragging為5％，與對(duì)照組（10％）已無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p>0.05）。SCI后7d，對(duì)照組和CCP組大鼠均開(kāi)始負(fù)重步行。對(duì)照組大鼠步長(zhǎng)11.64±0.39cm，步寬4.69±0.21cm，CCP可增加大鼠步長(zhǎng)12.98±0.22cm，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p<0.001），但步寬（4.22±0.20cm

6、）和對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p>0.05）。CCP治療后7d的TS1-5為1.632±0.011mm，TS2-4為0.816±0.065mm，與生理鹽水對(duì)照組相比（TS1-5為1.744±0.064mm，TS2-4為1.092±0.091mm），可明顯減少1-5和2-4趾間的距離，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p<0.05）。
　　這部分實(shí)驗(yàn)顯示：鹿瓜多肽在大鼠脊髓中度夾傷后可以促進(jìn)早期運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。
　　實(shí)驗(yàn)二:鹿瓜多肽促進(jìn)脊髓損傷后

7、神經(jīng)元的存活
　　存活神經(jīng)元：根據(jù)GFAP標(biāo)記的損傷區(qū)域，以損傷區(qū)域?yàn)橹行模謩e向吻、尾兩側(cè)各連續(xù)取2個(gè)連續(xù)的1mm區(qū)域作為評(píng)估存活神經(jīng)元區(qū)域，從吻側(cè)向尾側(cè)方向分別標(biāo)記為R2、R1、C1、C2區(qū)。我們首先評(píng)估了脊髓夾傷后7d時(shí)R1和C1區(qū)內(nèi)總的NeuN陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目。對(duì)照組為1316±120個(gè)，CCP處理組為1824±130個(gè)，兩組之間存在顯著性差異（p<0.05）。脊髓夾傷后14d，對(duì)照組為1015±244個(gè)，CCP組為1699

8、±177個(gè)，兩組之間存在顯著性差異（p<0.05）。此外又分別比較了對(duì)照組和CCP組R2,R1,C1和C2四個(gè)區(qū)域在7d時(shí)間點(diǎn)的神經(jīng)元數(shù)目，僅在R1區(qū)兩組之間存在顯著性差異（614±103vs928±56,p<0.05）。脊髓損傷后14d，也僅在R1區(qū)兩組之間存在顯著性差異（555±121vs885±76,p<0.05）。上述實(shí)驗(yàn)說(shuō)明：CCP可以促進(jìn)鄰近脊髓損傷區(qū)的神經(jīng)元存活。提示：促進(jìn)神經(jīng)元存活可能是CCP有利于脊髓損傷功能恢復(fù)的原因

9、之一。
　　實(shí)驗(yàn)三：鹿瓜多肽促進(jìn)脊髓損傷后的血管再生
　　RECA+血管面積：同實(shí)驗(yàn)一對(duì)神經(jīng)元計(jì)數(shù)的劃分區(qū)域，分別計(jì)數(shù)了R2、R1、C1和C2區(qū)內(nèi)RECA+血管面積。脊髓夾傷后7d，生理鹽水對(duì)照組在R2,R1,C1,C2四個(gè)區(qū)域的RECA+面積（mm2）分別為0.076±0.006,0.074±0.003,0.065±0.002和0.059±0.009，給予CCP處理后，各區(qū)域面積分別為0.139±0.007,0.133±0

10、.010,0.143±0.010和0.099±0.008。CCP治療組4個(gè)區(qū)域的RECA+面積與對(duì)照相比均有顯著增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p<0.05）。SCI后14d，CCP可以增加R1區(qū)（0.184±0.015）和C1區(qū)（0.156±0.008）RECA+面積，與生理鹽水組相應(yīng)區(qū)域R1（0.121±0.015）和C1（0.105±0.015）相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p<0.05），但對(duì)R2和C2區(qū)RECA+血管面積無(wú)影響。R1區(qū)內(nèi)7d和14

11、d時(shí)存活神經(jīng)元的數(shù)量與RECA+血管面積呈良好的線性正性相關(guān)。
　　VEGFmRNA水平在脊髓損傷后7d和14d出現(xiàn)一定程度下降。7d時(shí)夾傷組VEGF的相對(duì)表達(dá)量為0.00517±0.00056，給予CCP后VEGFmRNA水平明顯增加，其相對(duì)表達(dá)量達(dá)0.00759±0.00065，與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p<0.05）。至14d時(shí)，對(duì)照組VEGFmRNA水平仍保持在較低水平（0.00647±0.00021），CCP組VEGF

12、mRNA水平（0.00883±0.00065）仍顯著高于對(duì)照組，兩組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p<0.05）。CD31mRNA水平較假手術(shù)組正常大鼠（0.00341±0.00072）升高，7d和14d時(shí)的相對(duì)表達(dá)量分別為0.00484±0.0006和0.00492±0.00093。給予CCP治療后，CD31mRNA表達(dá)明顯增加，7d和14d的相對(duì)表達(dá)水平為0.00759±0.00072和0.00835±0.00066，與對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)生理鹽水對(duì)照

13、組和假手術(shù)組相比均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p<0.05）。假手術(shù)組VEGF受體Flk-1mRNA相對(duì)表達(dá)量為0.00134±0.00060。脊髓夾傷后7d和14d時(shí)的相對(duì)表達(dá)量分別為0.00211±0.00032和0.00162±0.00018，給予CCP后可明顯增加FLK-1mRNA的表達(dá)水平，對(duì)應(yīng)7d和14d的相對(duì)表達(dá)量分別為0.00430±0.00063和0.00308±0.00028，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p<0.05）。VEGF另一受體Fl

14、t-1mRNA表達(dá)水平在假手術(shù)組為0.00319±0.00124，脊髓損傷后7d和14d時(shí)的mRNA相對(duì)表達(dá)量與對(duì)應(yīng)CCP治療組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（0.00523±0.00098vs0.00557±0.00137,0.00553±0.00065vs0.00519±0.00085,p>0.05）。
　　該部分實(shí)驗(yàn)證明CCP可以促進(jìn)損傷旁區(qū)血管發(fā)生，增加的RECA+血管面積與存活神經(jīng)元之間具有高度的正性線性關(guān)系。CCP可以增加VEGF、

15、CD31以及VEGF受體Flk-1mRNA表達(dá)水平，即CCP可能通過(guò)VEGF-VEGFR-2途徑發(fā)揮受損脊髓損傷旁區(qū)的促血管生成作用。
　　實(shí)驗(yàn)四鹿瓜多肽促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞增生
　　GFAP染色：脊髓夾傷后4、7和14d，生理鹽水對(duì)照組的損傷區(qū)面積分別為2.06±0.27,1.60±0.15和1.16±0.28mm2。CCP可明顯減少4d時(shí)的損傷區(qū)面積到1.23±0.15mm2，7d時(shí)的損傷區(qū)面積到1.1±0.15mm2（p<

16、0.05）。SCI后14d，CCP處理組的損傷面積（0.93±0.22mm2）與對(duì)照組已無(wú)明顯差異（p>0.05）。與此同時(shí)，也降低了相應(yīng)4d和7d時(shí)GFAP的蛋白表達(dá)水平（p<0.05），14d時(shí)對(duì)照組和CCP組的GFAP水平無(wú)差異（p>0.05）。
　　體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：MTT顯示：CCP可以有效促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的活力和增殖；同樣流式細(xì)胞檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：CCP可以顯著提高處于S期和G2/M期星形膠質(zhì)細(xì)胞的比例。以上結(jié)果

17、均提示CCP可以促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖。
　　星形膠質(zhì)細(xì)胞體外劃傷的連續(xù)72小時(shí)觀察實(shí)驗(yàn)顯示：CCP可以顯著促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞遷移，減小劃傷面積。提示：CCP在脊髓損傷的早期階段活化星形膠質(zhì)細(xì)胞，促進(jìn)GFAP的表達(dá)，加速細(xì)胞遷移，縮小損傷區(qū)面積，促進(jìn)傷口愈合。
　　小結(jié)：通過(guò)以上的研究，CCP可以通過(guò)VEGF，CD31和VEGFR2（Flk-1）表達(dá)的升高促進(jìn)血管發(fā)生，挽救損傷周邊區(qū)神經(jīng)元，促進(jìn)運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。除此之外，CCP