羥基化甾體的生物合成.pdf

1、許多天然和半合成甾體化合物在醫(yī)藥領(lǐng)域和食品行業(yè)中占有重要地位。作為具有良好活性的藥用中間體，羥基化的甾體化合物天然含量稀少，提取繁瑣，化學(xué)合成困難，阻礙了對(duì)它們進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)研究。尋找方法解決這類(lèi)天然產(chǎn)物來(lái)源的問(wèn)題顯得迫在眉睫，希望通過(guò)生物催化的方法解決上述難題。
　　細(xì)胞色素P450氧化酶是甾體羥基化酶的典型代表，尤其是來(lái)源于巨大芽孢桿菌的P450BM3。利用合成生物學(xué)的手段研究P450，可以以一種經(jīng)濟(jì)又環(huán)保方式得到羥基化甾體中間

2、體。本論文主要論述了對(duì)細(xì)胞色素P450BM3突變體的功能鑒定和酶學(xué)性質(zhì)探究，及對(duì)來(lái)源于植物虎眼萬(wàn)年青的P450基因的克隆和表達(dá)，主要研究結(jié)果如下:
　　1.BM3突變體M01A82W、M01A82WS72I和M11A82W甾體底物特異性的研究
　　本實(shí)驗(yàn)以13種甾體化合物作為探針研究三個(gè)具有代表性的BM3突變體M01A82W、M01A82WS72I和M11A82W的底物特異性。酶促催化結(jié)果顯示只有3-keto-Δ4-ster

3、oids結(jié)構(gòu)的睪酮、甲睪酮、黃體酮、17α-OH黃體酮和雄烯二酮可以被羥基化得到不同位點(diǎn)和不同構(gòu)型的化合物，而其他8種3-hydro-Δ5-steroids不能被羥基化。結(jié)果表明pET28aM0182、M018272和M1182酶可能更偏愛(ài)3-keto-Δ4-steroids底物。
　　2.BM3突變體139-3催化甾體羥基化
　　本研究以BM3139-3及其突變體為生物催化劑篩選13種甾體底物，并對(duì)其進(jìn)行深入的酶學(xué)性質(zhì)研究

4、，以期擴(kuò)大其底物譜。酶促催化結(jié)果顯示，139-3能夠在1α位特異性將雄烯二酮羥基化為1α-OH-雄烯二酮。為了能夠工業(yè)化應(yīng)用BM3突變體139-3催化C-1α羥化反應(yīng)，進(jìn)行催化條件（反應(yīng)溫度，反應(yīng)時(shí)間，pH和底物濃度）的優(yōu)化。研究結(jié)果表明BM3突變體139-3在37℃，pH7.0反應(yīng)4小時(shí)，能獲得雄烯二酮37％的最高轉(zhuǎn)化率。此外，為了提高139-3酶活性和擴(kuò)大底物范圍，對(duì)139-3進(jìn)行隨機(jī)突變。測(cè)序結(jié)果表明139-3共有5個(gè)位點(diǎn)發(fā)生突變

5、，得到4個(gè)突變體，并且所有突變體在379位氨基酸處發(fā)生突變，導(dǎo)致R379S，而且失去了對(duì)雄烯二酮的羥基化活性。研究表明位于379位的精氨酸殘基在139-3的羥基化活性中起關(guān)鍵作用。
　　3.虎眼萬(wàn)年青中P450基因的克隆和表達(dá)
　　提取虎眼萬(wàn)年青無(wú)菌組織的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。依據(jù)虎眼萬(wàn)年青轉(zhuǎn)錄組序列，設(shè)計(jì)引物，利用巢式PCR克隆得到3條細(xì)胞色素P450氧化酶基因（Os5155、Os813和Os9107)。利用In-