露水草HMGR基因的克隆分析及20-羥基蛻皮甾酮生物合成調(diào)控研究.pdf

1、20-羥基蛻皮甾酮(20-hydroxyecdysterone,20E)是露水草(Cyanotis arachnoidea C.B.Clarke)植株中的主要甾酮活性成分,它不僅被廣泛應(yīng)用于蠶桑業(yè),而且具有許多藥理活性,能夠有效促進(jìn)哺乳動(dòng)物多種組織和器官的核酸與蛋白質(zhì)的合成,促進(jìn)糖代謝和脂類(lèi)代謝,改善高血糖癥和高血脂癥,調(diào)節(jié)免疫功能和中樞神經(jīng)系統(tǒng),改善和治療缺氧和缺血性腦損傷,因此受到了世界各地科學(xué)研究工作者的廣泛重視。然而,由于其結(jié)構(gòu)

2、復(fù)雜,化學(xué)合成不能用于商品生產(chǎn),其天然來(lái)源匱乏問(wèn)題始終制約著該化合物在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥業(yè)上的應(yīng)用。20E屬于植物甾酮類(lèi)化合物,3-羥基-3-甲基戊二酰CoA還原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase,HMGR)被認(rèn)為是甾酮合成中的關(guān)鍵限速酶,是細(xì)胞中類(lèi)異戊二烯生物合成途徑中的關(guān)鍵調(diào)控點(diǎn),所以研究HMGR對(duì)了解植物甾酮的生物合成及其調(diào)控具有重要的理論意義。
　　我們首先從露水草植株中克隆出露水

3、草HMGR基因(CaHMGR),其基因全長(zhǎng)為2037bp,由91bp的5,非翻譯區(qū)(untranslated region,UTR)、1800bp的開(kāi)放閱讀框(open reading frame,ORF)以及146bp的3,非翻譯區(qū)組成。開(kāi)放閱讀框編碼一條含有599個(gè)氨基酸的多肽,預(yù)測(cè)其等電點(diǎn)和分子量分別為7.25與64.0kDa。在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)上對(duì)CaHMGR進(jìn)行檢索比對(duì),我們發(fā)現(xiàn)CaHMGR與已報(bào)道的許多其他植物的HMGR的氨基

4、酸序列十分相似。對(duì)推導(dǎo)出的多肽序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)其含有兩個(gè)3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶 A(HMG-CoA)的結(jié)合域(ELPIGFVQLP和TTEGCLVA)和兩個(gè)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)的結(jié)合域(DAMGMNM和GTVGGGT)。通過(guò)利用Swiss-Modeling對(duì)CaHMGR進(jìn)行基于同源性的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型分析,結(jié)果表明CaHMGR蛋白具有錯(cuò)綜復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu),其催化結(jié)構(gòu)域包括L-結(jié)構(gòu)域、N-結(jié)構(gòu)域和S-結(jié)構(gòu)域,與其

5、他植物的HMGR的結(jié)構(gòu)域十分相似。這暗示CaHMGR與其他植物的HMGR存在一定的催化相似性,而且CaHMGR是一個(gè)有功能的還原酶。根據(jù)CaHMGR及其他植物、真菌、昆蟲(chóng)及動(dòng)物的HMGR構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù),結(jié)果表明HMGR都來(lái)自于一個(gè)共同的祖先并且逐漸進(jìn)化成四個(gè)分支,其中CaHMGR屬于植物HMGR這一分支,與陽(yáng)春砂HMGR的親緣關(guān)系最為接近。這些都說(shuō)明CaHMGR屬于植物HMGR超家族。
　　我們建立了CaHMGR的絕對(duì)熒光實(shí)時(shí)定量

6、PCR的檢測(cè)方法,并調(diào)查了茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)對(duì)CaHMGR表達(dá)模式的影響。我們?cè)O(shè)計(jì)了基因特異性引物CaHF和CaHR,熒光實(shí)時(shí)定量PCR的熔解曲線(xiàn)只有單個(gè)峰,特異性產(chǎn)物熔解曲線(xiàn)峰Tm為82.5℃,表明引物特異性良好。同時(shí),我們將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品10倍梯度稀釋成不同濃度為模板進(jìn)行反應(yīng),根據(jù)獲得的Ct值及基因拷貝數(shù)擬合曲線(xiàn),得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為y=-3.1116x+37.05,曲線(xiàn)擬合度R2達(dá)到0.9974,說(shuō)

7、明曲線(xiàn)線(xiàn)性關(guān)系良好,可用于準(zhǔn)確的定量。計(jì)算獲得的熒光實(shí)時(shí)定量PCR的擴(kuò)增效率為102.6％,同樣符合熒光實(shí)時(shí)定量PCR的要求。CaHMGR在根、莖及葉中都有表達(dá),在各組織表達(dá)的情況各異,其中在莖中表達(dá)最高,其次為根,再次為葉。MeJA對(duì)CaHMGR有明顯的誘導(dǎo)上調(diào)作用。MeJA處理組根和葉中 HMGR的表達(dá)為對(duì)照組的兩倍左右,而莖中HMGR的表達(dá)與對(duì)照組相比沒(méi)有顯著性差異。以上結(jié)果表明,CaHMGR是一個(gè)誘導(dǎo)響應(yīng)型基因,可被誘導(dǎo)子如Me

8、JA有效誘導(dǎo)。
　　采用MeJA、酵母誘導(dǎo)子(yeast elicitor,YE)及硝酸銀(AgNO3)三種誘導(dǎo)子刺激露水草懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系,當(dāng)施加0.2mM MeJA處理懸浮細(xì)胞時(shí),測(cè)得細(xì)胞中20E含量為80.95μg/g DW,為對(duì)照組的8倍,而AgNO3(25μM)處理組的含量為對(duì)照組的6倍,YE(100 mg/L)處理組的為對(duì)照組的2倍,說(shuō)明這三種誘導(dǎo)子均能明顯提高懸浮細(xì)胞中的20E的含量,為采用大規(guī)模生物反應(yīng)器生產(chǎn)20E

9、提供基礎(chǔ)研究。采用之前建立的熒光實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)露水草懸浮細(xì)胞中HMGR的表達(dá)水平,結(jié)果表明三種誘導(dǎo)子均能明顯提高CaHMGR的表達(dá)水平。我們的結(jié)果顯示CaHMGR可被誘導(dǎo)子誘導(dǎo)高表達(dá)從而更多的甲羥戊酸可被合成進(jìn)入類(lèi)異戊二烯生物合成途徑用以合成萜類(lèi)或植物甾體化合物。
　　在本文中,我們首次從露水草中克隆出 HMGR基因,對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析以及表達(dá)模式分析并調(diào)查了MeJA、YE及AgNO3三種誘導(dǎo)子對(duì)露水草懸浮細(xì)胞中20