CpG-ODN與受體TLR9在酸性條件下特異性結(jié)合的研究.pdf

1、CpG-ODN是一些發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌中含有未甲基化的CpG二核苷酸對(duì)并且具有免疫激活作用的寡核苷酸。大量研究已證明CpG-ODN具有直接激活B細(xì)胞增殖、促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟及誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子等作用。應(yīng)用基礎(chǔ)方面的研究表明CpG-ODN可以作為一類(lèi)新型的免疫佐劑在抗腫瘤、抗感染和防治哮喘等方面具有非常樂(lè)觀的應(yīng)用前景。鑒于CpG-ODN廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用及應(yīng)用潛力，對(duì)其細(xì)胞內(nèi)分子作用機(jī)制的研究成為當(dāng)前的一個(gè)熱點(diǎn)，而焦點(diǎn)問(wèn)題是尋找免疫

2、細(xì)胞上CpG-ODN的特異性識(shí)別受體并闡明其信號(hào)跨膜傳遞的機(jī)制。 最近的研究發(fā)現(xiàn)CpG-ODN的特異性識(shí)別受體極可能是Toll-Like-Receptors(TLRs)家族的新成員——TLR9，證據(jù)主要來(lái)自基因敲除小鼠，即如果將TLR9或TLR家族共用的下游信號(hào)分子的接頭分子——MyD88的基因敲除后，則基因敲除小鼠的免疫細(xì)胞就失去了對(duì)CpG-ODN刺激的應(yīng)答性，而且TLR9是一種膜蛋白，其胞外部分含有與甲基化CpG-DNA結(jié)合

3、蛋白MBD-1-4同源的DNA結(jié)合域，這提示CpG-ODN系與TLR9結(jié)合之后再通過(guò)接頭分子MyD88向內(nèi)傳遞激活信號(hào)。但令人困惑的是目前一直未能直接觀察到TLR9與CpG-ODN的特異性相互作用，而且免疫細(xì)胞膜上并不存在CpG-ODN的特異性結(jié)合位點(diǎn)。盡管ODN能與細(xì)胞膜結(jié)合，但這些結(jié)合均沒(méi)有CpG序列的特異性，而且證據(jù)表明免疫細(xì)胞對(duì)CpG-ODN的特異性識(shí)別及信號(hào)觸發(fā)不是發(fā)生于細(xì)胞外膜上，而是繼發(fā)于CpG-ODN被細(xì)胞內(nèi)吞和內(nèi)體酸化

4、之后。據(jù)此我們推測(cè)：如果TLR9的確是CpG-ODN的特異性受體，則TLR9與CpG-ODN的特異性結(jié)合及相關(guān)激活信號(hào)的觸發(fā)極有可能發(fā)生于CpG-ODN被內(nèi)吞之后的酸性?xún)?nèi)體中，而不是發(fā)生于細(xì)胞外膜上。亦即TLR9與CpG-ODN的特異性結(jié)合極有可能需要一個(gè)特定的外在條件即偏酸性的pH環(huán)境。 為證實(shí)上述推測(cè)，我們?cè)谘芯恐斜容^了不同pH條件下CpG-ODN與細(xì)胞膜的結(jié)合及其免疫調(diào)節(jié)活性，發(fā)現(xiàn)：在中性pH條件下ODNs與免疫細(xì)胞膜的結(jié)

5、合的確沒(méi)有序列選擇性，但在偏酸性pH條件卻能觀察到CpG-ODN與免疫細(xì)胞膜有特異性結(jié)合，而且在微偏酸條件下，免疫細(xì)胞對(duì)CpG-ODN的刺激更加敏感。另外，我們以RT-PCR方法從小鼠脾細(xì)胞mRNA中擴(kuò)增出TLR9基因，將胞外區(qū)亞克隆至pcDNA3.1真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入COS7細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物可被抗小鼠TLR9抗體特異性識(shí)別；以凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物與ODNs在不同pH條件下的相互作用，發(fā)現(xiàn)偏酸條件下(pH6.4)表達(dá)產(chǎn)物與OD

6、Ns的結(jié)合較中性條件下明顯增強(qiáng)，而且與CpG-ODN的結(jié)合強(qiáng)于作為對(duì)照的非CpG序列ODN，說(shuō)明重組表達(dá)的TLR9胞外區(qū)能以pH依賴(lài)方式與CpG-ODN特異性結(jié)合。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步支持我們的猜想，據(jù)此我們提出可能存在一種新的胞外刺激信號(hào)跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)方式，即CpG-ODN系與其受體TLR9一起內(nèi)吞進(jìn)入內(nèi)體并酸化后方能發(fā)生CpG序列特異性的高親和力結(jié)合，進(jìn)而啟動(dòng)下游信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。這與傳統(tǒng)的胞外刺激分子與膜受體的結(jié)合及激活信號(hào)觸發(fā)均發(fā)生于細(xì)胞外膜