TCF21基因多態(tài)性與中國漢族女性乳腺癌發(fā)病風(fēng)險的關(guān)聯(lián)研究及功能分析.pdf

1、第一部分 TCF21基因在乳腺癌中的表達(dá)及其功能
　　目的:檢測TCF21基因在人乳腺癌細(xì)胞和組織中的表達(dá)，并分析其表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，同時觀察TCF21基因過表達(dá)對乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。
　　方法:(1)通過實時定量PCR(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)和蛋白免疫印跡(Western blot)方法檢測TCF21基因在人乳腺癌細(xì)胞MDA-M

2、B-231和MCF-7，人正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A和39例術(shù)后乳腺癌組織及其癌旁正常組織中的表達(dá)，并分析癌組織中TCF21 mRNA表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系。(2)利用生物信息軟件KM-plotter分析乳腺癌組織中TCF21 mRNA表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系。(3)采用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將重組質(zhì)粒pcDNA3.1-TCF21和空質(zhì)粒pcDNA3.1分別轉(zhuǎn)染至乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，并運用RT-qPCR和Westernblot方法檢測質(zhì)

3、粒轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中TCF21基因的表達(dá)情況。(4) CCK-8法和AnnexinⅤ-FITC/PI雙染色法分別被用于檢測TC F21基因過表達(dá)對乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖和凋亡的影響。
　　結(jié)果:(1)乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞中TCF21 mRNA和蛋白的表達(dá)水平均顯著低于正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A。隨后采用同樣的方法檢測39例人乳腺癌組織及其癌旁正常組織中TCF21 mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示TCF21m

4、RNA在36例乳腺癌組織中低表達(dá)，在1例乳腺癌組織中表達(dá)無差異，在2例乳腺癌組織中高表達(dá)。對TCF21mRNA低表達(dá)的乳腺癌組織進(jìn)行Western blot檢驗，發(fā)現(xiàn)TCF21蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)水平也顯著低于癌旁正常組織，與mRNA檢測結(jié)果一致。通過進(jìn)一步分析乳腺癌組織中TCF21 mRNA表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系，我們發(fā)現(xiàn)TCF21 mRNA表達(dá)水平與患者年齡、TNM分期、腫瘤分化程度、ER、PR及HER2的表達(dá)無關(guān)，但與腫

5、瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。TCF21 mRNA低表達(dá)更容易發(fā)生在大尺度腫瘤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性的腫瘤中。(2) KM-plotter分析結(jié)果顯示乳腺癌組織中TCF21 mRNA表達(dá)水平與患者總生存率無關(guān)，但與患者無復(fù)發(fā)生存率有關(guān)。與TCF21 mRNA高表達(dá)患者相比，TCF21 mRNA低表達(dá)患者的無復(fù)發(fā)生存率顯著降低(P=4.7e-07)。(3)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)TCF21 mRNA和蛋白的表達(dá)量明顯增加。

6、(4)與對照組相比，TCF21基因過表達(dá)不僅能抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的增殖，還能促進(jìn)細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)論:TCF21基因作為抑癌基因在人乳腺癌細(xì)胞及大多數(shù)乳腺癌組織中低表達(dá)，并且TCF21基因低表達(dá)與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤體積增大及不良預(yù)后有關(guān)。進(jìn)一步體外實驗證實TCF21基因過表達(dá)能夠抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡。
　　第二部分 TCF21基因多態(tài)性與中國漢族女性乳腺癌發(fā)病風(fēng)險的關(guān)系及其

7、機(jī)制
　　目的:研究TCF21基因標(biāo)簽單核苷酸多態(tài)性(tag single nucleotidepolymorphisms，tagSNPs)與中國漢族女性乳腺癌發(fā)病風(fēng)險的關(guān)系，并利用基因型-表型關(guān)聯(lián)分析及體外細(xì)胞實驗研究差異多態(tài)性位點參與乳腺癌發(fā)生的分子機(jī)制。
　　方法:(1)利用Haploview4.2軟件從HapMap數(shù)據(jù)庫中獲取中國漢族人群TCF21基因tagSNPs。(2)采用多重聚合酶鏈反應(yīng)-連接酶檢測反應(yīng)技術(shù)對9

8、01例乳腺癌患者（病例組）和1225例健康個體（對照組）TCF21基因tagSNPs進(jìn)行分型，并運用擬合優(yōu)度卡方檢驗分析對照組中各多態(tài)性位點基因型分布是否符合哈迪-溫伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium，HWE）。(3)利用logistic回歸模型分析TC F21基因tagSNPs與中國漢族女性乳腺癌發(fā)病風(fēng)險的關(guān)系。(4)通過RT-qPCR方法檢測乳腺癌組織和癌旁正常組織中TCF21 mRNA的表達(dá)，并使用單因

9、素方差分析檢測差異多態(tài)性位點(rs12190287 C＞G)基因型與TCF21mRNA表達(dá)量的關(guān)系。(5)鑒于rs12190287位點位于TCF21基因3'非翻譯區(qū)(3'untranslated region，3'UTR)，生物信息學(xué)軟件TargetScan和miRanda被用于預(yù)測與該多態(tài)性位點結(jié)合的特異miRNA。(6)采用RT-qPCR方法檢測乳腺癌細(xì)胞及組織中特異miRNA的表達(dá)。(7)通過直接測序法檢測乳腺癌 MDA-MB-2

10、31細(xì)胞中rs12190287位點基因型。(8)使用miRecords軟件和TSGene數(shù)據(jù)庫獲取乳腺癌中特異miRNA的潛在靶基因。(9)化學(xué)合成特異miRNA mimic和inhibitor，并通過功能獲得性研究和功能缺失性研究分析乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中特異miRNA對TCF21基因及其潛在靶基因（SMAD4，PPP2R1B, GGNBP2，NUAK1）表達(dá)的影響。(10)采用DNA重組和定點突變技術(shù)構(gòu)建pmirGLO-T

11、CF21-3'UTR-C和pmirGLO-TCF21-3'UTR-G雙熒光素酶報告基因載體，分析rs12190287位點不同等位基因?qū)μ禺恗iRNA發(fā)揮調(diào)控作用的影響。
　　結(jié)果:(1)利用Haploview4.2軟件和HapMap數(shù)據(jù)庫從TCF21基因中獲得6個tagSNPs(rs2327429 T＞C, rs2327430 T＞C, rs2327433 A＞G, rs12190287C＞G, rs7766238 G＞A, rs

12、4896011 T＞A)，其中2個tagSNPs(rs2327429 T＞C,rs2327430 T＞C)位于基因啟動子區(qū)，1個tagSNP(rs2327433 A＞G)位于基因內(nèi)含子區(qū)，3個tagSNPs(rs12190287 C＞G，rs7766238 G＞A，rs4896011 T＞A)位于基因3'UTR。(2)基因分型結(jié)果表明，對照組中tagSNPs位點基因型頻率分布均符合HWE:rs2327429位點的PHWE值為0.61，r

13、s2327430位點的PHWE值為0.79，rs2327433位點的PHWE值為0.74，rs12190287位點的PHWE值為0.94，rs7766238位點的PHWE值為0.06，rs4896011位點的PHWE值為0.08。(3)病例對照研究結(jié)果顯示，TCF21 rs12190287位點多態(tài)性與中國漢族女性乳腺癌發(fā)病風(fēng)險有關(guān)(G vs.C，OR=0.80，95％CI=0.71-0.91，P=0.001; GG vs.CC，OR=0

14、.64，95％CI=0.49-0.84,P=0.001; CG vs.CC, OR=0.81,95％CI=0.68-0.98,P=0.03; GG+ CG vs.CC, OR=0.77,95％CI=0.64-0.92, P=0.003; GG vs.CG+CC, OR=0.72,95％CI=0.56-0.92，P=0.007)。進(jìn)一步基于年齡的分層分析結(jié)果表明，rs12190287位點多態(tài)性不僅與50歲以下女性乳腺癌發(fā)病風(fēng)險有關(guān)(G v

15、s.C，OR=0.85，95％CI=0.73-0.99, P=0.04; GG+CG vs.CC, OR=0.80,95％CI=0.64-0.99，P=0.04)，還與50歲及以上女性乳腺癌發(fā)病風(fēng)險有關(guān)(Gvs.C，OR=0.72，95％CI=0.58-0.89，P=0.002; GG vs.CC, OR=0.52,95％CI=0.34-0.80, P=0.003; GG+CG vs.CC,OR=0.72,95％CI=0.54-0.97

16、, P=0.03; GG vs.CG+CC, OR=0.58,95％CI=0.39-0.86,P=0.01)?；诓±眍愋偷姆謱臃治鼋Y(jié)果表明，TCF21 rs12190287位點多態(tài)性只與乳腺浸潤性導(dǎo)管癌的發(fā)病風(fēng)險有關(guān)（Gvs.C，OR=0.78，95％CI=0.68-0.89，P＜0.001; GG vs.CC, OR=0.59,95％CI=0.45-0.79, P＜0.001; CG vs.CC, OR=0.82,95％CI=0.6

17、7-0.99, P=0.04; GG+CG vs.CC, OR=0.76,95％CI=0.83-0.91, P=0.003;GG vs.CG+ CC，OR=0.67，95％CI=0.51-0.86，P=0.002）。基于腫瘤期的分層分析結(jié)果表明，rs12190287位點多態(tài)性不僅與I+II期乳腺癌發(fā)病風(fēng)險有關(guān)(G vs.C，OR=0.80,95％CI=0.70-0.92,P=0.002; GG vs.CC, OR=0.59,95％CI=

18、0.44-0.80,P=0.001; GG+CG vs.CC, OR=0.79,95％CI=0.65-0.96,P=0.02; GG vs.CG+CC,OR=0.64，95％CI=0.49-0.85，P=0.002），還與Ⅲ+Ⅳ期乳腺癌發(fā)病風(fēng)險有關(guān)(G vs.C, OR=0.79,95％CI=0.65-0.97, P=0.03; GG vs.CC, OR=0.66,95％CI=0.44-0.99,P=0.05; CG vs.CC, OR

19、=0.57,95％CI=0.41-0.79,P=0.001; GG+CG vs.CC,OR=0.60，95％CI=0.44-0.80，P=0.001）。(4)基因型-表型關(guān)聯(lián)分析顯示，癌旁正常組織中rs12190287位點基因型與TCF21 mRNA表達(dá)量相關(guān)。與rs12190287CC基因型癌旁正常組織相比，GG基因型癌旁正常組織中TCF21 mRNA表達(dá)量顯著增加。(5)生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，rs12190287位點位于hsa-m

20、iR-224與TCF21 mRNA3'UTR結(jié)合的種子區(qū)域，其中rs12190287 C等位基因有助于hsa-miR-224對TCF21基因表達(dá)的調(diào)控。(6)RT-qPCR檢測結(jié)果表明hsa-miR-224在乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著高于正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A。通過檢測30例乳腺癌組織及其癌旁正常組織中hsa-miR-224的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)hsa-miR-224在14例乳腺癌組織中高表達(dá)，在7例乳腺癌組織中表達(dá)無

21、差異，在9例乳腺癌組織中低表達(dá)。(7)測序分型結(jié)果表明乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中rs12190287位點基因型為CC純合子，提示hsa-miR-224可能參與調(diào)控乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中TCF21基因的表達(dá)。(8)進(jìn)一步生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，hsa-miR-224也可能參與調(diào)控乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中SMAD4，PPP2R1B，GGNBP2和NUAK1基因的表達(dá)。(9)功能獲得性研究結(jié)果表明，hsa-miR-22

22、4過表達(dá)能夠顯著抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中TCF21、PPP2R1B、GGNBP2和NUAK1基因mRNA的表達(dá)。功能缺失性研究結(jié)果表明，hsa-miR-224抑制能夠顯著上調(diào)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中TC F21和GGNBP2基因mRNA的表達(dá)。(10)雙熒光素酶活性分析結(jié)果表明，rs12190287G等位基因能夠干擾hsa-miR-224與TCF21 mRNA3'UTR的結(jié)合，從而增加TCF21基因的表達(dá)。