p38 MAPK信號(hào)通道介導(dǎo)的GLP-1對(duì)AGEs誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷的干預(yù)機(jī)制.pdf

1、背景：
　　糖尿病(Diabetes mellitus, DM)可并發(fā)多種血管并發(fā)癥，如糖尿病腎病、動(dòng)脈粥樣硬化、中風(fēng)、心衰等，而后者是其致殘致死的重要原因。內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂是DM并發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis, AS)發(fā)生的早期信號(hào)，因此，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能對(duì)治療及預(yù)防糖尿病血管病變具有重要意義。糖基化終末產(chǎn)物（Advanced glycation endproducts, AGEs）的積累與DM多種血管并發(fā)

2、癥的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)。研究表明，AGEs可導(dǎo)致多種細(xì)胞因子分泌異常及細(xì)胞代謝紊亂，進(jìn)而引起內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變和功能異常。糖尿病高糖狀態(tài)下，AGEs生成明顯加速，并在血管壁沉積而難以降解，通過(guò)與其受體結(jié)合后激活氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)活性氧(reactive oxygen species, ROS)生成明顯增加，破壞內(nèi)皮細(xì)胞功能，導(dǎo)致線粒體功能障礙，并促使其凋亡。因此，如何對(duì)抗AGEs的血管損傷效應(yīng)，已成為眾多學(xué)者關(guān)注的問(wèn)題。
　　p38細(xì)胞

3、絲裂素活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase, p38 MAPK）信號(hào)通路為MAPK家族的重要成員，該通路作用的發(fā)揮主要是通過(guò)磷酸化p38 MAPK（p-p38 MAPK）實(shí)現(xiàn)的。研究顯示，p38 MAPK信號(hào)通路的激活與血管損傷和器官微循環(huán)的病理生理改變有著密切關(guān)聯(lián)。如AGEs通過(guò)p38 MAPK信號(hào)通路介導(dǎo)了腎臟微血管內(nèi)皮的損傷及血流屏障的影響；抑制p38 MAPK活化可減輕高糖誘導(dǎo)的

4、腎小球系膜細(xì)胞氧化應(yīng)激水平，使ROS生成量降低；高糖干預(yù)人冠狀動(dòng)脈一段時(shí)間后，可通過(guò)增強(qiáng)NADPH氧化酶活性，使ROS產(chǎn)生增加，而高糖及ROS均可激活p38 MAPK信號(hào)通路，從而誘導(dǎo)細(xì)胞損傷。高糖及ROS均可激活p38MAPK磷酸化而促進(jìn)細(xì)胞凋亡已得到共識(shí)，但其具體機(jī)制尚不明確。文獻(xiàn)報(bào)道，一定濃度的AGEs可通過(guò)p38 MAPK信號(hào)通路介導(dǎo)，使內(nèi)皮細(xì)胞中內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）表達(dá)下調(diào)，NO生成減少，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。
　

5、　胰高血糖素樣肽1（Glucagon like Peptide-1, GLP-1)是由腸道內(nèi)分泌細(xì)胞和腦神經(jīng)細(xì)胞分泌的多肽類激素，不僅可通過(guò)促進(jìn)胰島素分泌、抑制胰高血糖素釋放等發(fā)揮良好的降糖效果，還具有心血管系統(tǒng)保護(hù)作用，是治療 T2DM非常有前景的新藥。近年研究顯示，除抗炎作用外，GLP-1還可通過(guò)cAMP/PKA、PI3K/Akt、NADPH、p38 MAPK等信號(hào)途徑發(fā)揮抗氧化損傷作用，從而對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮有效保護(hù)作用。研究表明，在

6、高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷中，GLP-1或其類似物Exendin-4可激活PI3K/Akt，提高NO水平從而促內(nèi)皮細(xì)胞增殖；而其下游信號(hào)通道 p38MAPK-eNOS也在 GLP-1保護(hù)高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷中發(fā)揮重要作用。但目前相關(guān)研究仍甚少。
　　由此可見(jiàn)，在DM各種代謝紊亂的環(huán)境中，激活氧化應(yīng)激是AGEs誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的關(guān)鍵病理因素。GLP-1在降糖的同時(shí)，可拮抗AGEs誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激而保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞。然而，其具體保護(hù)機(jī)

7、制尚不明了。本研究以 AGEs誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVECs）為研究模型，探討p38 MAPK-信號(hào)通道在GLP-1干預(yù)AGEs誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的作用機(jī)制，從而為疾病的發(fā)生及治療研究展示廣闊的前景。
　　目的：
　　本課題以AGEs誘導(dǎo)的HUVECs損傷為研究模型，通過(guò)檢測(cè)GLP-1對(duì)p38 MAPK信號(hào)通道及其下游eNOS蛋白表達(dá)的影響

8、，觀察GLP-1或p38 MAPK抑制劑干預(yù)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞ROS生成及細(xì)胞凋亡的作用，初步探討p38 MAPK信號(hào)通道在GLP-1干預(yù)AGEs誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的作用機(jī)制。
　　方法：
　　1. HUVECs的分離、培養(yǎng)及鑒定
　　根據(jù)前期經(jīng)驗(yàn)獲取、分離、培養(yǎng)HUVECs，細(xì)胞經(jīng)vWF抗體免疫熒光染色進(jìn)行鑒定。取第3-5代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　2.體外制備、鑒定AGEs
　　1.6 g牛血清白蛋白（B

9、SA）與3.0 g D-葡萄糖溶于10 mL PBS中，避光孵育12周制備AGEs。熒光分光光度計(jì)鑒定AGEs。以同樣條件下不含糖的BSA溶液孵育12周后制備的溶液作為本實(shí)驗(yàn)的陰性對(duì)照組。
　　3.Western blotting法檢測(cè)p38 MAPK、eNOS磷酸化作用
　　陰性對(duì)照組、AGEs組、GLP-1組、AGEs+GLP-1組分別檢測(cè)p38 MAPK磷酸化蛋白及總p38 MAPK蛋白表達(dá)；陰性對(duì)照組、AGEs組、A

10、GEs+GLP-1組、AGEs+p38 MAPK抑制劑組、AGEs+GLP-1+p38 MAPK抑制劑組分別檢測(cè)eNOS磷酸化蛋白及總eNOS蛋白表達(dá)。
　　p38 MAPK抑制劑預(yù)處理細(xì)胞1 h后，加入（或不加）GLP-1100 nM干預(yù)30 min,最后加400 ug/mL AGEs作用24 h(本課題前期研究顯示，400 ug/mL AGEs作用24 h后，可顯著誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡；GLP-1采用100 nm濃度下，可顯著抑制

11、AGEs誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡)。陰性對(duì)照組采用與AGEs相同濃度的BSA溶液。（以下部分均按該方法操作，不再贅述。）
　　4.流式細(xì)胞儀檢測(cè)GLP-1及p38 MAPK抑制劑對(duì)細(xì)胞ROS生成水平及細(xì)胞凋亡率的影響。
　　實(shí)驗(yàn)分6組：陰性對(duì)照組、AGEs組、GLP-1組、AGEs+GLP-1組、AGEs+p38 MAPK抑制劑組、AGEs+GLP-1+p38 MAPK抑制劑組。
　　細(xì)胞接種于6孔板，隨機(jī)進(jìn)行分組處理，DCFH

12、-DA熒光探針檢測(cè)細(xì)胞ROS含量，Annexin V/PI染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。
　　5.硝酸還原酶法檢測(cè)eNOS抑制劑使用前后AGEs及AGEs+GLP-1處理組細(xì)胞NO生成水平。
　　6. Annexin V/PI雙染色法檢測(cè)eNOS抑制劑使用前后AGEs及AGEs+GLP-1處理組的細(xì)胞凋亡率。
　　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：
　　數(shù)據(jù)采用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x-±s）表示，多組比較采用單向

13、方差分析（One-Way ANOVA）檢驗(yàn)，兩兩比較采用LSD法。P<0.050為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.GLP-1對(duì)AGEs誘導(dǎo)下HUVECs p38 MAPK磷酸化作用的影響
　　方差分析顯示，各組間細(xì)胞磷酸化p38 MAPK蛋白表達(dá)具有顯著差異（F=56.989,P=0.000），而總p38 MAPK蛋白表達(dá)無(wú)變化（F=0.568,P=0.652）。與BSA對(duì)照組比較，AGEs可顯著活化內(nèi)皮細(xì)胞p

14、38 MAPK蛋白磷酸化（P=0.001），而GLP-1可拮抗該活化作用（P=0.000）。
　　2.p38 MAPK抑制劑（SB203580）對(duì)HUVECseNOS磷酸化作用的影響
　　予以不同處理后，各組間細(xì)胞磷酸化 eNOS蛋白表達(dá)具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=6.645,P=0.007），但總eNOS水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=1.677,P=0.231）。與BSA對(duì)照相比較，AGEs可顯著降低磷酸化 eNOS表達(dá)水平（P=0.

15、007），GLP-1及SB203580均可拮抗AGEs對(duì)磷酸化eNOS的抑制作用（P=0.004）（P=0.011）。
　　3.AGEs誘導(dǎo)下，GLP-1及p38 MAPK抑制劑對(duì)HUVECs ROS生成及細(xì)胞凋亡的影響
　　與 BSA對(duì)照組相比，AGEs處理組 ROS生成水平及細(xì)胞凋亡率顯著增高（P=0.000）（P=0.000），GLP-1單獨(dú)處理并不影響細(xì)胞ROS生成量及細(xì)胞凋亡率（P=0.170）（P=0.234）；

16、而AGEs組加入GLP-1或SB203580后，細(xì)胞ROS水平均顯著減弱（ P=0.000）（ P=0.006），細(xì)胞凋亡率顯著下降（ P=0.000）（P=0.000）；予以SB203580預(yù)處理后，GLP-1對(duì)AGEs誘導(dǎo)ROS生成及細(xì)胞凋亡的拮抗作用無(wú)改變（P=0.828）（P=0.424）。
　　4. AGEs誘導(dǎo)下，GLP-1及eNOS抑制劑（L-NAME）對(duì)HUVECs NO生成水平的影響
　　方差分析后多重比較

17、顯示，與BSA陰性對(duì)照組相比，AGEs可明顯降低NO生成水平（P=0.000），而 GLP-1單獨(dú)處理對(duì)細(xì)胞 NO生成的影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.055）；AGEs組加入GLP-1后，細(xì)胞NO含量較單純AGEs處理組顯著升高（P=0.000）；而在AGEs+ GLP-1組予以L-NAME預(yù)處理細(xì)胞后，細(xì)胞NO含量較AGEs+ GLP-1組降低（P=0.011）。
　　5. AGEs誘導(dǎo)下，eNOS抑制劑對(duì)GLP-1抗細(xì)胞凋亡的影響

18、
　　加入 GLP-1與 AGEs共孵育后，細(xì)胞凋亡率較單純 AGEs組顯著降低（P=0.000）；而在AGEs+GLP-1共孵育組加入L-NAME后，GLP-1的抗凋亡作用顯著減弱（P=0.002）。
　　結(jié)論：
　　1.AGEs可激活血管內(nèi)皮細(xì)胞p38 MAPK信號(hào)通道，而GLP-1可拮抗該作用。
　　2.GLP-1可通過(guò)抑制p38 MAPK信號(hào)通道的活化，拮抗AGEs誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)及細(xì)胞凋亡