黃粉甲抗凍蛋白的原核表達、純化及活性檢測.pdf

1、昆蟲抗凍蛋白具有較高的抗凍活性，生物體內微量的抗凍蛋白很難滿足諸多方面應用。因此，探索出生產抗凍蛋白的有效方法亟待解決。本研究基于此目的利用基因工程的技術和方法開展了抗凍蛋白基因的分子克隆和表達工作。以黃粉甲為材料，提取4℃冷處理4周的黃粉甲脂肪體總RNA；運用RT-PCR技術擴增和克隆出了afp72，afp84a，afp84b，afp84c，afp84d，afp84e六個黃粉甲抗凍蛋白基因，并在Genbank中注冊。其中基因afp72

2、經核酸和蛋白水平分析確定為新的黃粉甲抗凍蛋白基因，目的基因afp72，afp84a與其它抗凍蛋白基因具有高度同源性(分別達到79.48％和98.81％)，分別編碼72和84個氨基酸的成熟蛋白，AFP72缺少由12氨基酸組成的的重復單元，保守單元TXT在不同序列中具有高度保守性。將基因afp72，afp84a與載體pMAL-c2X和pMAL-p2X雙酶切后連接，構建兩個融合表達質粒pMAL-c2X-afp72，pMAL-c2X-afp84

3、a和兩個分泌融合表達質粒pMAL-p2X-72，pMAL-p2X-84a；表達質粒轉化E.coliTBI后，經IPTG誘導表達，目的蛋白表現為可溶性；通過優(yōu)化組合，最適的發(fā)酵條件是：誘導溫度為25℃，初始誘導菌濃度A600為0.6左右，誘導時間為8小時，IPTG濃度為0.5mmol/L。超聲波細胞破碎法使融合蛋白AFP72從含有融合表達質粒pMAL-c2X-afp72的細胞中釋放。對于分泌融合表達質粒pMAL-p2X-afp84a，Mg