黃粉甲抗凍蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)及抗凍活性研究.pdf

1、抗凍蛋白是20世紀(jì)60年代首先從極地魚血淋巴中分離的一種蛋白質(zhì)，它可以抑制冰晶的生長并以非依數(shù)形式降低溶液的冰點(diǎn)，不影響熔點(diǎn)，因而導(dǎo)致溶液的冰點(diǎn)與熔點(diǎn)出現(xiàn)一差值。對抗凍蛋白的基礎(chǔ)研究及其在生物技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域的研究已經(jīng)成為目前國際上一個比較熱門的研究方向。人們試圖通過轉(zhuǎn)基因方法使抗凍蛋白在原核生物中(如大腸桿菌)表達(dá)，利用生物反應(yīng)器來定向生產(chǎn)AFP。但是就目前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，抗凍蛋白在原核生物體內(nèi)往往不能被正確的加工而形成有活性的AFP，且

2、用大腸桿菌表達(dá)的蛋白以包涵體的形式存在，這樣對后續(xù)的分析工作十分困難。故我們建立了以畢赤酵母為宿主菌的表達(dá)系統(tǒng)。本實(shí)驗(yàn)擬通過畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，利用畢赤酵母質(zhì)粒pPIC9K中含有的釀酒酵母基因組的α因子，有效地分泌表達(dá)出具有生物活性的抗凍蛋白TmAFP，為TmAFP的應(yīng)用研究打下結(jié)實(shí)的基礎(chǔ)，并在條件合適的情況下工業(yè)化。 本論文思路如下：采用PCR技術(shù)，以pMAL-p2X-afp84a和pMAL-p2X-afp72載體為模板擴(kuò)增出a

3、fp84a，afp72基因，克隆到pUCm-T 載體中測序并保存。按分子克隆的方法，通過雙酶切將afp84a，afp72基因定向重組到畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K中。然后用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入畢赤酵母宿主菌GS115，通過選擇性培養(yǎng)基MM和MD篩選出重組畢赤酵母菌株。用0.5％甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，在最適溫度30℃的環(huán)境條件下，誘導(dǎo)表達(dá)出活性蛋白，用硫酸銨濃度梯度沉淀初步純化酵母真核表達(dá)產(chǎn)物，通過細(xì)菌低溫保護(hù)實(shí)驗(yàn)檢測抗凍蛋白TmAFP低