黃粉甲抗凍蛋白在畢赤酵母中的表達及抗凍活性研究.pdf

1、抗凍蛋白是20世紀60年代首先從極地魚血淋巴中分離的一種蛋白質，它可以抑制冰晶的生長并以非依數(shù)形式降低溶液的冰點，不影響熔點，因而導致溶液的冰點與熔點出現(xiàn)一差值。對抗凍蛋白的基礎研究及其在生物技術應用領域的研究已經成為目前國際上一個比較熱門的研究方向。人們試圖通過轉基因方法使抗凍蛋白在原核生物中(如大腸桿菌)表達，利用生物反應器來定向生產AFP。但是就目前的實驗結果來看，抗凍蛋白在原核生物體內往往不能被正確的加工而形成有活性的AFP，且

2、用大腸桿菌表達的蛋白以包涵體的形式存在，這樣對后續(xù)的分析工作十分困難。故我們建立了以畢赤酵母為宿主菌的表達系統(tǒng)。本實驗擬通過畢赤酵母表達系統(tǒng)，利用畢赤酵母質粒pPIC9K中含有的釀酒酵母基因組的α因子，有效地分泌表達出具有生物活性的抗凍蛋白TmAFP，為TmAFP的應用研究打下結實的基礎，并在條件合適的情況下工業(yè)化。 本論文思路如下：采用PCR技術，以pMAL-p2X-afp84a和pMAL-p2X-afp72載體為模板擴增出a

3、fp84a，afp72基因，克隆到pUCm-T 載體中測序并保存。按分子克隆的方法，通過雙酶切將afp84a，afp72基因定向重組到畢赤酵母表達載體pPIC9K中。然后用醋酸鋰轉化法將重組質粒轉化入畢赤酵母宿主菌GS115，通過選擇性培養(yǎng)基MM和MD篩選出重組畢赤酵母菌株。用0.5％甲醇誘導表達，在最適溫度30℃的環(huán)境條件下，誘導表達出活性蛋白，用硫酸銨濃度梯度沉淀初步純化酵母真核表達產物，通過細菌低溫保護實驗檢測抗凍蛋白TmAFP低