SA-Hifn-α工作2a雙功能融合蛋白的原核表達、純化及體外活性檢測.pdf

1、目的:
　　 本研究利用本室早期構(gòu)建的pET24a-SA-L-hIFN-α2a重組表達質(zhì)粒，在大腸桿菌中表達融合蛋白SA-hIFN-α2a，并對所表達的蛋白采用鎳金屬螯合(Ni-NTA)層析進行純化，尿素梯度透析復性，大量制備鏈親合素(SA)標記的人源α2a型干擾素融合蛋白(SA-hIFN-α2a)，并對其體外活性進行檢測，為進一步的動物實驗奠定基礎。
　　 方法:
　　 1．誘導表達SA-hIFN-α2a融合蛋

2、白
　　 用傳統(tǒng)的CaCl2方法制備Rosetta感受態(tài)細胞，首先從大腸桿菌DH5α(由本室保存，含質(zhì)粒pET24a-SA-L-hIFN-α2a)中提取目的質(zhì)粒，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細胞中進行活化，經(jīng)IPTG誘導表達，高壓細胞破碎儀破菌，包涵體洗滌。最后應用SDS-PAGE分析檢測表達產(chǎn)物。
　　 2．融合蛋白SA-hIFN-α2aIPTG誘導條件的優(yōu)化
　　 通過調(diào)整IPTG的誘導時間和誘導濃度，應用SDS-PA

3、GE鑒定結(jié)果，篩選出最佳的誘導條件。
　　 3．WesternBloting鑒定SA-hIFN-α2a融合蛋白的表達
　　 通過對未經(jīng)IPTG誘導表達的菌液和表達后的產(chǎn)物進行免疫印跡分析鑒定，以hIFN-α2a抗體為一抗，以辣根過氧化物酶(HRP)標記-羊抗鼠IgG為二抗，采用DAB顯色法進行顯色，以鑒定SA-hIFN-α2a融合蛋白的表達情況。
　　 4．包涵體洗滌、純化及復性
　　 通過細胞壓力破碎儀

4、破菌收得包涵體(鎳柱親和層析)，應用本室已成功研制的包涵體洗滌方法進行洗滌，包涵體經(jīng)過洗滌后用8M尿素溶解進行鎳柱親和層析純化，通過尿素梯度透析復性后得到融合蛋白，進行SDS-PAGE鑒定結(jié)果，并分析復性后蛋白的純度和濃度。
　　 5．干擾素抗病毒增殖實驗和腫瘤細胞錨定實驗
　　 將復性的SA-hIFN-α2a融合蛋白采用微量細胞病變抑制法通過A549/VSV系統(tǒng)測定SA-hIFN-α2a的抗病毒增活性；應用流式細胞儀檢

5、測SA-hIFN-α2a融合蛋白對膀胱癌細胞MB49細胞的錨定率，初步評價經(jīng)純化復性后SA-hIFN-α2a融合蛋白的體外活性。
　　 結(jié)果:
　　 1．誘導表達SA-hIFN-α,2a融合蛋白
　　 將質(zhì)粒pET24a-SA-L-hIFN-α2a導入大腸桿菌中后，在帶有氯霉素和卡鈉霉素抗性的平板中經(jīng)過37℃、16-48h孵育后生長出單克隆菌落，并使菌落過夜活化后37℃、220rpm、0.5mmol/LIPTG條

6、件下誘導表達。經(jīng)SDS-PAGE鑒定目的蛋白出現(xiàn)在約33KD的位置，經(jīng)BandScan軟件分析，SA-hIFN-α2a目的蛋白約占總蛋白的15％。表達菌通過高壓破碎后，SDS-PAGE顯示目的蛋白主要以包涵體的形式存在于沉淀中。
　　 2．融合蛋白SA-hIFN-α2aIPTG誘導條件的優(yōu)化
　　 經(jīng)過SDS-PAGE鑒定，IPTG誘導時間在4h誘導終濃度為0.5mmol/L時為最佳誘導條件。
　　 3．West

7、ernBloting鑒定SA-hIFN-α2a融合蛋白的表達
　　 將菌體重懸于PBS緩沖液，高壓破碎1次(1000MPa)，可達到很好的破菌效果。經(jīng)洗滌液洗后的包涵體用8M尿素溶解后經(jīng)過鎳柱親和層析進行分離純化，目的蛋白被100mmol/L濃度咪唑洗出。經(jīng)尿素梯度透析復性，復性后的目的條帶經(jīng)SDS-PAGE鑒定融合蛋白的非還原狀態(tài)主要以多聚體的形式存在，經(jīng)BandScan軟件分析純度為97％，采用Bradford法測定蛋白濃度

8、為288.96μg/ml。
　　 5．干擾素抗病毒增殖實驗和腫瘤細胞錨定實驗
　　 通過A549NSV系統(tǒng)鑒定了重組SA-hIFN-α2a融合蛋白對接毒的A549細胞有很好的保護作用，對VSV有明顯的抑制效果。我們采用微量細胞病變抑制法，通過A549/VSV系統(tǒng)對重組的SA-hIFN-α2a融合蛋白進行了體外活性測定，其效價約為6.14×107IU/mg；流式細胞儀檢測SA-hIFN-α2a融合蛋白對經(jīng)生物素化的MB49