融合表達人白細胞介素-2（hIL-2）和增強型綠色熒光蛋白（EGFP）的逆轉錄病毒載體的構建.pdf

1、本研究的主要目的是構建融合表達人白細胞介素-2(hlL-2)和增強型綠色熒光蛋白(EGFP)的逆轉錄病毒載體。首先設計合成一段150bp的接頭序列，將其插入載體pUC57的多克隆位點中，稱為pUC-MCS。酶切質粒pUC-MCS和pRevTet-On后，分別回收目的片段進行連接，將連接子轉化E.coli DH5a，篩選連接正確的質粒，命名為pRev-MCS。對質粒pRev-MCS和pEGFP-Cl進行酶切，構建重組質pRevEGFP-C

2、1。同時對質粒pBV220-IL-2和pEGFP-C1進行酶切連接，重組為過渡質粒pEGFP-Cl-IL-2。再分別酶切質粒pRevEGFP-Cl和pEGFP-Cl-IL-2，連接重組為可融合表達IL-2和EGFP的逆轉錄病毒載體pRevEGFP-Cl-IL-2，經(jīng)酶切等檢測分析證明，構建的載體pRevEGFP-Cl-IL-2完全符合設計方案。利用脂質體Lipofectin將構建好的質粒轉入包裝細胞PT67中，經(jīng)G418選擇性培養(yǎng)液篩選

3、后得到具有G418抗性的PT67細胞克隆。將抗性克隆進行擴大培養(yǎng)，得到能夠產(chǎn)生逆轉錄病毒載體的包裝細胞PT67／Cl-IL-2。取PT67／CL-IL-2細胞的培養(yǎng)上清，經(jīng)不同比例稀釋后感染NIH3T3細胞進行滴定，測得重組逆轉錄病毒載體的滴度為7X10<‘4> CFU／ml。進一步取PT67／Cl-IL-2細胞的培養(yǎng)上清，感染MH3T3細胞后，在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光。利用hIL-2 ELISA試劑盒檢測，經(jīng)感染的MH3T3細胞分