含增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的BMP2真核載體的構(gòu)建和表達(dá).pdf

1、目的： 骨創(chuàng)傷、骨腫瘤和畸形矯形導(dǎo)致的骨缺損是臨床常見而又很棘手的問題，所以移植骨需求量很大，現(xiàn)有自體骨或同種異體骨移植等方法存在諸多局限性。組織工程為人們尋找新的骨修復(fù)替代材料提供了一條新的途徑。組織工程是應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和工程學(xué)原理，將生長因子、種子細(xì)胞和支架材料在體外整合在一起然后移植到人體內(nèi)所需要的部位，從而達(dá)到器官修復(fù)或再造治療目的一種技術(shù)。本研究選擇骨誘導(dǎo)活性蛋白(BMPs)家族中活性最強(qiáng)的誘導(dǎo)成骨因子BMP2(BMP

2、2)。到目前為止，BMP2在原核細(xì)胞中的表達(dá)的報(bào)道仍存在一些不足。例如，在大腸桿菌中表達(dá)真核蛋白，不能進(jìn)行翻譯后修飾，諸如不能完成蛋白的糖基化、磷酸化和二硫鍵的形成等，所以不易制得具備天然活性的蛋白質(zhì)。真核細(xì)胞能夠表達(dá)具有生物功能的BMP2，但存在體內(nèi)細(xì)胞很難定位的問題。本研究構(gòu)建攜帶有BMP2基因的綠色熒光蛋白表達(dá)載體，即可以實(shí)現(xiàn)在真核細(xì)胞中表達(dá)BMP2，又可以達(dá)到體內(nèi)示蹤定位目的，為后期骨組織工程動(dòng)物試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。 方法：

3、 依據(jù)Genbank中hBMP-2序列化學(xué)合成兩條引物，在目的基因的5’端非翻譯區(qū)添加限制性內(nèi)切酶BamHl位點(diǎn)和Kozak序列，Kozak序列可以增強(qiáng)核蛋白體小亞基與mRNA起始位點(diǎn)的結(jié)合，和在其3’端添加雙終止密碼子和限制性內(nèi)切酶NheI位點(diǎn)。上下游酶切位點(diǎn)均加入保護(hù)性堿基。有學(xué)者認(rèn)為，在大腸桿菌E.coli中編碼hBMP-2羧基端不同長短的氨基酸肽段的hBMP-2 cDNA表達(dá)，具不同程度的誘導(dǎo)成骨活性，而且愈接近成熟肽長度

4、活性愈高。因此，克隆其全長成為必需。為后期組織工程的臨床應(yīng)用需要，保持BMP2蛋白的分泌功能，本文成功地克隆了完整編碼區(qū)人BMP-2信號肽、前肽和成熟肽基因。 本實(shí)驗(yàn)克隆人BMP2 cDNA全長(含有69個(gè)信號肽序列、726個(gè)前肽序列，342個(gè)成熟肽序列，和形成二硫鍵必需的半胱氨酸(Cys))。在已有全長型人BMP2重組哺乳類表達(dá)載體pcDNA3.1/CT．hBMP2的基礎(chǔ)上，以pcDNA3.1/CT-hBMP2為模板，運(yùn)用PC

5、R技術(shù)擴(kuò)增得到重組hBMP-2全長片段，將其亞克隆構(gòu)建成pTA2-hBMP2載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，提取重組質(zhì)粒，酶切鑒定并測序。購買表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α后提取重組質(zhì)粒，表達(dá)質(zhì)粒和重組子pTA2-hBMP2均用BamHI和NheI雙酶切后回收DNA片段，將所得目的基因片段插入克隆載體pSELECT-GFP zeo-MCS并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α后提取重組質(zhì)粒，酶切鑒定并測序。按照LipofectmineTM2000 Re

6、agent說明書將上述空環(huán)狀質(zhì)粒表達(dá)載體和重組表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)染含5％胎牛血清的條件培養(yǎng)基DMEM中的COS7細(xì)胞中，48 h后熒光顯微鏡觀察，采用免疫熒光化學(xué)方法和Western Blotting鑒定。 結(jié)果： 經(jīng)0．8％瓊脂糖電泳顯示：PCR產(chǎn)物為一長約1216bp的帶。將其連接線型T-easy克隆載體，陽性克隆質(zhì)粒經(jīng)雙酶切可得約1216bp的片段，測序證實(shí)與Genbank中的序列完全相符。重組表達(dá)載體pSELEC

7、T-GFP zeo-hBMP2經(jīng)雙酶切酶切可得約1216bp的片段，測序證實(shí)與Genbank中的序列完全相符。重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞后 48h 熒光顯微鏡證實(shí)轉(zhuǎn)染成功，免疫熒光化學(xué)證實(shí)BMP2可在真核細(xì)胞中表達(dá)。Western Blotting亦證實(shí)重組蛋白有免疫原性，完整肽分子量大小在 45 kD 左右。 結(jié)論： 本次研究成功構(gòu)建含有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因的BMP2真核表達(dá)載體，能夠在真核細(xì)胞中表達(dá)分泌BMP2改