含增強型綠色熒光蛋白的BMP2真核載體的構(gòu)建和表達.pdf

1、目的： 骨創(chuàng)傷、骨腫瘤和畸形矯形導致的骨缺損是臨床常見而又很棘手的問題，所以移植骨需求量很大，現(xiàn)有自體骨或同種異體骨移植等方法存在諸多局限性。組織工程為人們尋找新的骨修復替代材料提供了一條新的途徑。組織工程是應用細胞生物學和工程學原理，將生長因子、種子細胞和支架材料在體外整合在一起然后移植到人體內(nèi)所需要的部位，從而達到器官修復或再造治療目的一種技術(shù)。本研究選擇骨誘導活性蛋白(BMPs)家族中活性最強的誘導成骨因子BMP2(BMP

2、2)。到目前為止，BMP2在原核細胞中的表達的報道仍存在一些不足。例如，在大腸桿菌中表達真核蛋白，不能進行翻譯后修飾，諸如不能完成蛋白的糖基化、磷酸化和二硫鍵的形成等，所以不易制得具備天然活性的蛋白質(zhì)。真核細胞能夠表達具有生物功能的BMP2，但存在體內(nèi)細胞很難定位的問題。本研究構(gòu)建攜帶有BMP2基因的綠色熒光蛋白表達載體，即可以實現(xiàn)在真核細胞中表達BMP2，又可以達到體內(nèi)示蹤定位目的，為后期骨組織工程動物試驗奠定基礎(chǔ)。 方法：

3、 依據(jù)Genbank中hBMP-2序列化學合成兩條引物，在目的基因的5’端非翻譯區(qū)添加限制性內(nèi)切酶BamHl位點和Kozak序列，Kozak序列可以增強核蛋白體小亞基與mRNA起始位點的結(jié)合，和在其3’端添加雙終止密碼子和限制性內(nèi)切酶NheI位點。上下游酶切位點均加入保護性堿基。有學者認為，在大腸桿菌E.coli中編碼hBMP-2羧基端不同長短的氨基酸肽段的hBMP-2 cDNA表達，具不同程度的誘導成骨活性，而且愈接近成熟肽長度

4、活性愈高。因此，克隆其全長成為必需。為后期組織工程的臨床應用需要，保持BMP2蛋白的分泌功能，本文成功地克隆了完整編碼區(qū)人BMP-2信號肽、前肽和成熟肽基因。 本實驗克隆人BMP2 cDNA全長(含有69個信號肽序列、726個前肽序列，342個成熟肽序列，和形成二硫鍵必需的半胱氨酸(Cys))。在已有全長型人BMP2重組哺乳類表達載體pcDNA3.1/CT．hBMP2的基礎(chǔ)上，以pcDNA3.1/CT-hBMP2為模板，運用PC

5、R技術(shù)擴增得到重組hBMP-2全長片段，將其亞克隆構(gòu)建成pTA2-hBMP2載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，提取重組質(zhì)粒，酶切鑒定并測序。購買表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α后提取重組質(zhì)粒，表達質(zhì)粒和重組子pTA2-hBMP2均用BamHI和NheI雙酶切后回收DNA片段，將所得目的基因片段插入克隆載體pSELECT-GFP zeo-MCS并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α后提取重組質(zhì)粒，酶切鑒定并測序。按照LipofectmineTM2000 Re

6、agent說明書將上述空環(huán)狀質(zhì)粒表達載體和重組表達載體分別轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)染含5％胎牛血清的條件培養(yǎng)基DMEM中的COS7細胞中，48 h后熒光顯微鏡觀察，采用免疫熒光化學方法和Western Blotting鑒定。 結(jié)果： 經(jīng)0．8％瓊脂糖電泳顯示：PCR產(chǎn)物為一長約1216bp的帶。將其連接線型T-easy克隆載體，陽性克隆質(zhì)粒經(jīng)雙酶切可得約1216bp的片段，測序證實與Genbank中的序列完全相符。重組表達載體pSELEC

7、T-GFP zeo-hBMP2經(jīng)雙酶切酶切可得約1216bp的片段，測序證實與Genbank中的序列完全相符。重組表達載體轉(zhuǎn)染COS7細胞后 48h 熒光顯微鏡證實轉(zhuǎn)染成功，免疫熒光化學證實BMP2可在真核細胞中表達。Western Blotting亦證實重組蛋白有免疫原性，完整肽分子量大小在 45 kD 左右。 結(jié)論： 本次研究成功構(gòu)建含有增強型綠色熒光蛋白基因的BMP2真核表達載體，能夠在真核細胞中表達分泌BMP2改