脫細(xì)胞豬小腸黏膜下層為支架構(gòu)建組織工程角膜上皮的可行性研究.pdf

1、研究背景:
　　角膜上皮的完整性是維持角膜透明及正常視功能的基礎(chǔ)，其穩(wěn)定性依賴于角膜緣干二細(xì)胞(Limbal Stem Cells, LSCs)的不斷增殖分化及向心性移動(dòng)。眼表疾?。⊿tevens-Johnson綜合征、化學(xué)、熱、輻射損傷、廣泛的微生物感染）和遺傳性疾?。ㄏ忍煨詿o(wú)虹膜）可以引發(fā)嚴(yán)重或完全的角膜緣干細(xì)胞缺乏(Limbal StemCell Deficiency, LSCD)或功能障礙，進(jìn)而導(dǎo)致角膜上皮缺損、進(jìn)行性角膜

2、結(jié)膜化、新生血管化、慢性炎癥、角膜渾濁、甚至失明。目前LSCs移植是治療LSCD及功能障礙的最主要方法，但自體LSCs取材有限，同種異體角膜供體來(lái)源嚴(yán)重匱乏及免疫排斥反應(yīng)等限制了其在臨床上的應(yīng)用。因此，組織工程角膜上皮的構(gòu)建成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)，理想的支架材料是其構(gòu)建的關(guān)鍵要素。
　　目的:
　　應(yīng)用不同濃度的十二烷基磺酸鈉(Sodium Dodecyl Sulfate，SDS)脫細(xì)胞處理豬小腸黏膜下層(Small Intes

3、tine Submucosa，SIS)，篩選制備脫細(xì)胞SIS的最佳濃度時(shí)間，并檢測(cè)其生物相容性及生物安全性，探討脫細(xì)胞SIS用于構(gòu)建組織工程角膜上皮載體的可行性。
　　方法:
　　配制濃度為0.1％、0.2％、0.3％、0.5％的SDS液體，分別脫細(xì)胞處理SIS15min、30min、1h、2h(n=20)，同時(shí)在脫細(xì)胞過(guò)程中觀察SIS的大體形態(tài)學(xué)變化，蘇木素-伊紅(Hematoxylin And Eosin，HE)和4，6

4、-二脒基-2-苯基吲哚(4，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染色組織學(xué)觀察脫細(xì)胞前后SIS的生物學(xué)特性，并對(duì)脫細(xì)胞后SIS支架行基因組DNA分析(n=5)以初步評(píng)價(jià)各種濃度時(shí)間SDS液體的脫細(xì)胞效果;將篩選的脫細(xì)胞效果徹底、組織學(xué)結(jié)構(gòu)保留完整的標(biāo)本進(jìn)行單軸拉伸實(shí)驗(yàn)測(cè)定其生物力學(xué)性能，并以正常豬SIS作對(duì)照，篩選出機(jī)械力學(xué)性能良好的脫細(xì)胞標(biāo)本。應(yīng)用上述篩選的脫細(xì)胞濃度時(shí)間處理SIS，并用掃描電鏡(Scann

5、ing Electron Microscopy，SEM)、透射電鏡(TransmissionElectron Microscopy，TEM)觀察脫細(xì)胞SIS的超微結(jié)構(gòu);ELISA實(shí)驗(yàn)對(duì)生長(zhǎng)因子含量進(jìn)行定量分析;CCK-8檢測(cè)脫細(xì)胞SIS浸提液對(duì)兔角膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞毒性;脫細(xì)胞SIS標(biāo)本大鼠皮下埋植觀察免疫排斥反應(yīng);兔角膜基質(zhì)囊袋內(nèi)植入脫細(xì)胞SIS植片及兔角膜上皮細(xì)胞接種在脫細(xì)胞SIS植片上的接種實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證體內(nèi)及體外的生物相容性;細(xì)胞免疫熒

6、光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)角膜上皮特異性標(biāo)記物CK3的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　脫細(xì)胞SIS肉眼觀為乳白色、半透明的膜狀物、而且具有一定的彈性、韌性和透光性;HE和DAPI染色光學(xué)顯微鏡檢查結(jié)果顯示0.1％及0.2％濃度SDS處理30min時(shí)SIS支架材料無(wú)細(xì)胞、細(xì)胞碎片及DNA物質(zhì)殘留，膠原纖維排列規(guī)則、有序，組織大體結(jié)構(gòu)保留完整;基因組DNA檢測(cè)提示0.1％及0.2％濃度SDS處理30min的脫細(xì)胞SIS支架細(xì)胞及DNA成分去除徹底，脫細(xì)

7、胞率可達(dá)90％以上;生物力學(xué)檢測(cè):0.1％SDS處理30min組與正常SIS組比較，極限抗張強(qiáng)度無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，而0.2％SDS處理30min組與正常SIS組及0.1％SDS處理30min組比較均有顯著性差異(P＜0.05)。各組彈性模及斷裂伸長(zhǎng)率(％)比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05);SEM和TEM檢查脫細(xì)胞SIS膠原纖維排列整齊，纖維間孔隙率增加，超微結(jié)構(gòu)基本與正常SIS相似;脫細(xì)胞SIS生長(zhǎng)因子含量與正常SIS相比無(wú)

8、顯著性差異(P＞0.05）;脫細(xì)胞SIS浸提液對(duì)兔角膜上皮細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)無(wú)顯著影響;脫細(xì)胞SIS大鼠皮下埋植無(wú)明顯移植術(shù)后免疫排斥反應(yīng);兔角膜基質(zhì)囊袋移植脫細(xì)胞SIS表現(xiàn)出良好的生物相容性;兔角膜上皮細(xì)胞在脫細(xì)胞SIS呈復(fù)層生長(zhǎng)，相鄰細(xì)胞間存在緊密連接;角膜上皮CK3表達(dá)陽(yáng)性。
　　結(jié)論:
　　0.1％SDS脫細(xì)胞處理30min是制備脫細(xì)胞豬SIS最為理想的濃度時(shí)間;脫細(xì)胞SIS有一定的機(jī)械力學(xué)性能、良好的生物相容性及生物安全