以脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)為支架體外培養(yǎng)人角膜上皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞的實驗研究.pdf

1、研究背景:
　　角膜透明是維持人眼正常視覺功能的重要前提條件，但臨床上各種外傷、炎癥、變性等均引起角膜的混濁，造成嚴(yán)重的視力障礙，導(dǎo)致角膜盲。目前，新近不斷開展的角膜屈光手術(shù)使得角膜供體材料嚴(yán)重不足以及移植術(shù)后的免疫排斥反應(yīng)導(dǎo)致大多數(shù)角膜病患者得不到及時有效的角膜移植治療。因此，利用組織工程技術(shù)三維構(gòu)建人類角膜組織等替物成為近年來研究的熱點，為廣大角膜盲患者帶來了新的希望。本實驗研究體外培養(yǎng)獲得原代人角膜上皮細(xì)胞與基質(zhì)成纖維細(xì)胞，

2、再以脫細(xì)胞的豬角膜基質(zhì)(Acellular Porcine Corneal Matrix，APCM)為支架材料，探索人角膜細(xì)胞與異種脫細(xì)胞豬角膜的組織相容性，并嘗試構(gòu)建組織工程人角膜前板層。
　　目的: 人角膜上皮細(xì)胞與角膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞體外分離培養(yǎng)，種植于脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)材料，以此探討人角膜細(xì)胞與脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)的生物相容性，并進(jìn)一步構(gòu)建人角膜前板層。
　　方法: 角膜手術(shù)后剩余的角膜緣環(huán)組織去除了鞏膜、虹膜、結(jié)膜等組織后

3、切成幾塊放入中性蛋白酶Ⅱ液中孵育1小時后，用鑷子將角膜緣細(xì)胞刮除，再將獲得的上皮細(xì)胞團(tuán)用胰酶消化為單個細(xì)胞。去除上皮的角膜緣組織放于膠原酶Ⅰ中孵育3小時后，可見有組織塊消失，大量細(xì)胞漂浮，離心后用含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸放入孵箱內(nèi)培養(yǎng)。0.5％ SDS處理新鮮的豬角膜得到脫細(xì)胞豬角膜支架，H.E.染色，DAPI染色及透射電鏡檢測支架材料中殘余細(xì)胞成分與膠原成分。培養(yǎng)基孵育APCM支架48小時后可得到支架浸取液，再將人

4、角膜成纖維細(xì)胞與角膜上皮細(xì)胞分別用獲得的浸取液培養(yǎng)，MTT方法分析角膜細(xì)胞的增殖能力。在角膜細(xì)胞接種之前將冰凍的脫細(xì)胞豬角膜支架加入培養(yǎng)基后放入37℃孵育箱中孵育24小時。1ml胰島素針將培養(yǎng)的第3代角膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞注入APCM材料內(nèi)培養(yǎng)3天，將獲得的第1代角膜緣上皮細(xì)胞接種于APCM支架材料的前板層表面，再共培養(yǎng)10天。H.E.染色，組織免疫熒光與免疫組織化學(xué)的方法用于觀察構(gòu)建人角膜前板層的結(jié)構(gòu)。
　　結(jié)果: APCM的H.

5、E.染色未發(fā)現(xiàn)殘余細(xì)胞，DAPI染色未發(fā)現(xiàn)DNA成分。透射電鏡示脫細(xì)胞豬角膜支架內(nèi)未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞成分，可觀察到膠原成分排列整齊規(guī)則。脫細(xì)胞豬角膜支架的浸取物組對角膜上皮細(xì)胞與基質(zhì)成纖維細(xì)胞的增殖能力與DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)組相比差別分別無明顯意義。H.E.染色示角膜上皮細(xì)胞接種于APCM支架表面3天后，可觀察到其前表面有單層細(xì)胞樣結(jié)構(gòu)，5天后可見到2-3層細(xì)胞，10天后可見到3-5層細(xì)胞。角膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞注入到脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)3天可見

6、基質(zhì)內(nèi)部有散在細(xì)胞分布，注射針處較多，并可見膠原成分?jǐn)嗔?第5天，7天后可見支架材料內(nèi)部細(xì)胞成分不斷增多。構(gòu)建10天的角膜前板層表面有3-5層細(xì)胞，支架內(nèi)部可見散在分布的細(xì)胞，膠原有斷裂的地方。構(gòu)建物的組織形態(tài)與細(xì)胞表型與正常人角膜前板層的組織形態(tài)與細(xì)胞表型基本一致。H.E.染色示構(gòu)建物的前表面可有3-5層細(xì)胞生長，內(nèi)部有散在不均一的細(xì)胞成分。組織免疫熒光觀察構(gòu)建人角膜前板層表層的細(xì)胞成分高表達(dá)標(biāo)志物CK12，材料內(nèi)部可見表達(dá)標(biāo)志物Vi