異種脫細(xì)胞結(jié)膜基質(zhì)為支架構(gòu)建組織工程角膜上皮的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　 探討脫細(xì)胞結(jié)膜基質(zhì)的制備方法；評(píng)價(jià)以脫細(xì)胞結(jié)膜基質(zhì)為支架構(gòu)建組織工程角膜上皮的可行性及觀察其治療角膜緣干細(xì)胞缺乏癥的效果。
　　 方法：
　　 1.脫細(xì)胞結(jié)膜基質(zhì)的制備
　　 37℃條件下,豬球結(jié)膜用0.1％SDS作用不同時(shí)間進(jìn)行脫細(xì)胞處理,根據(jù)HE染色結(jié)果篩選出最佳的脫細(xì)胞條件。用該方法處理的結(jié)膜在超凈臺(tái)內(nèi)通風(fēng)干燥,γ-射線消毒后制備成脫細(xì)胞結(jié)膜基質(zhì)。
　　 2.脫細(xì)胞結(jié)膜基質(zhì)的相

2、關(guān)檢測(cè)
　　 檢測(cè)脫細(xì)胞結(jié)膜基質(zhì)的透光率、厚度、彈性、微生物、抗原性、穩(wěn)定性、生物相容性及超微結(jié)構(gòu)；倒置顯微鏡觀察,HE、臺(tái)盼藍(lán)-茜素紅、免疫熒光染色對(duì)以其為支架接種的角膜上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)情況、活性及性質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)；透射電鏡觀察角膜上皮細(xì)胞間及上皮與支架間的連接情況,評(píng)價(jià)以脫細(xì)胞結(jié)膜基質(zhì)為支架構(gòu)建組織工程角膜上皮的可行性。
　　 3.脫細(xì)胞結(jié)膜基質(zhì)為支架構(gòu)建兔組織工程角膜上皮的應(yīng)用
　　 (1)兔角膜緣干細(xì)胞缺乏動(dòng)物

3、模型的建立與評(píng)價(jià)
　　 用切除角膜緣干細(xì)胞組織聯(lián)合角膜上皮化學(xué)燒傷的方法建立,并通過(guò)潘志強(qiáng)的角膜上皮評(píng)分方法及印跡細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果來(lái)評(píng)價(jià)動(dòng)物模型。
　　 (2)兔組織工程角膜上皮的構(gòu)建
　　 培養(yǎng)兔原代角膜上皮細(xì)胞,并用流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)其中的干細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)；將熒光染料CM-DiI標(biāo)記的種子細(xì)胞接種到支架上進(jìn)行培養(yǎng)。
　　 (3)兔組織工程角膜上皮的移植
　　 15只角膜緣干細(xì)胞缺乏兔隨機(jī)分成3組,每組

4、5只。A組:移植以脫細(xì)胞結(jié)膜基質(zhì)為支架構(gòu)建的組織工程角膜上皮；B組:移植以去上皮羊膜為支架構(gòu)建的組織工程角膜上皮；C組:移植脫細(xì)胞結(jié)膜基質(zhì)。術(shù)后在裂隙燈顯微鏡下觀察各組角膜混濁及新生血管情況；A組和B組行角膜熒光顯微鏡、印跡細(xì)胞學(xué)檢查、HE染色,觀察組織工程角膜上皮治療兔角膜緣干細(xì)胞缺乏癥的效果。
　　 結(jié)果：
　　 1.0.1％SDS作用12h可將球結(jié)膜中的細(xì)胞完全脫除,且對(duì)膠原影響小。
　　 2.脫細(xì)胞結(jié)膜基

5、質(zhì)的透光率、彈性、穩(wěn)定性及生物相容性良好,厚度為52.6±4.8μm,無(wú)細(xì)菌及真菌生長(zhǎng),無(wú)抗原性,其膠原纖維排列較緊密、規(guī)整、無(wú)細(xì)胞成分。脫細(xì)胞結(jié)膜基質(zhì)上培養(yǎng)的HCECs與同一培養(yǎng)皿中的細(xì)胞形態(tài)和密度相同、活性良好且保持上皮細(xì)胞的性質(zhì)；上皮細(xì)胞之間、細(xì)胞與脫細(xì)胞結(jié)膜基質(zhì)之間存在緊密連接,上皮可形成多層。
　　 3.動(dòng)物模型建立1月后,20只兔中有18只角膜混濁在2分及以上,角膜新生血管在3分及以上,角膜上皮印跡細(xì)胞學(xué)檢查顯示有P

6、AS染色陽(yáng)性的杯狀細(xì)胞,為構(gòu)建成功的角膜緣干細(xì)胞缺乏動(dòng)物模型。
　　 4.培養(yǎng)的兔原代角膜上皮細(xì)胞中P63所占比例為14.6％； CM-DiI標(biāo)記的種子細(xì)胞在脫細(xì)胞結(jié)膜基質(zhì)支架上形成多層,兔組織工程角膜上皮構(gòu)建成功。
　　 5.組織工程角膜上皮移植術(shù)后7d,各組角膜混濁及新生血管與術(shù)前相當(dāng)；術(shù)后14d,A組和B組角膜混濁及新生血管較術(shù)前稍好轉(zhuǎn),而C組角膜新生血管較術(shù)前有所增加；術(shù)后30d,A組角膜恢復(fù)透明,新生血管明顯減

7、少,B組角膜透明度及新生血管較術(shù)前好轉(zhuǎn),而C組較術(shù)前稍差。術(shù)后7d,熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)A組和B組角膜周邊部有較多種子細(xì)胞,中央部?jī)H有數(shù)個(gè)細(xì)胞；HE染色顯示A組角膜上皮開始修復(fù),而B組未開始修復(fù)。術(shù)后1月,熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)A組角膜周邊部和中央部均有較多種子細(xì)胞,而B組周邊部種子細(xì)胞減少,中央部細(xì)胞同前；HE染色及印跡細(xì)胞學(xué)檢查顯示A組角膜上皮完全修復(fù),而B組仍異常。
　　 結(jié)論：
　　 1.SDS脫細(xì)胞處理,通風(fēng)干燥,γ