基于脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)的組織工程人角膜基質(zhì)的體外重建及其動物移植研究.pdf

1、角膜位于眼球的最表面，因直接與外界接觸故易受到損傷或感染，一旦受到損傷和發(fā)生病變，就會引起角膜混濁，造成視力的減退甚至喪失。角膜病是我國主要的致盲病之一，僅次于白內(nèi)障，我國現(xiàn)有角膜病盲患者近500萬人，而全世界現(xiàn)有角膜病盲患者近6000萬人，其中大部分是由于角膜基質(zhì)異常而引起的，而且還在逐年遞增。角膜病尤其是角膜盲不僅給患者個人帶來巨大的痛苦，在生活上還需要家人等的照顧，給家庭和社會帶來了巨大的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。目前，治療角膜盲的唯一有效方法就

2、是進行角膜移植，但由于角膜供體的嚴(yán)重短缺，無法滿足現(xiàn)有眾多角膜病盲患者治療的需要。近年來，角膜組織工程技術(shù)的興起使體外重建出組織工程人角膜成為可能，而體外重建的組織工程人角膜基質(zhì)，作為捐獻(xiàn)角膜的替代物，已成為眾多角膜病盲患者通過角膜移植而復(fù)明的唯一希望。
　　組織工程人角膜基質(zhì)的體外重建急需解決足量種子細(xì)胞的來源和理想生物相容性載體支架的制備問題。本實驗室通過多年研究，已建立了多個非轉(zhuǎn)染人角膜基質(zhì)細(xì)胞系，初步成功解決了種子細(xì)胞的來

3、源問題，并初步建立了脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)制備的技術(shù)工藝，本文擬在已有技術(shù)工藝的基礎(chǔ)上，通過改進和優(yōu)化利用豬角膜基質(zhì)制備出脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)，并利用本實驗室業(yè)已建立的非轉(zhuǎn)染人角膜基質(zhì)細(xì)胞系細(xì)胞對其進行生物相容性研究，進而以脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)為載體支架、以非轉(zhuǎn)染人角膜基質(zhì)細(xì)胞為種子細(xì)胞，開展組織工程人角膜基質(zhì)的體外重建研究，并對體外重建所得組織工程人角膜基質(zhì)的形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能蛋白表達(dá)進行鑒定，最后利用新西蘭兔和比格犬的板層角膜基質(zhì)移植進行生物學(xué)功能驗

4、證，評估組織工程人角膜基質(zhì)作為捐獻(xiàn)角膜替代物用于臨床角膜移植的可行性。
　　本文首先開展了脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)的優(yōu)化制備研究，采用脫氧膽酸鈉-原釩酸鈉混合液處理、反復(fù)凍融和DNA-RNA酶處理等技術(shù)工藝對豬角膜基質(zhì)進行了脫細(xì)胞處理，制備出脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)，在利用HE染色、冰凍切片的熒光染色以及透射電子顯微鏡技術(shù)對其形態(tài)結(jié)構(gòu)進行鑒定的基礎(chǔ)上，又對其透光性能及其孔隙率等理化性質(zhì)進行了檢測。鑒定結(jié)果顯示，所得脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)中膠原纖維排列規(guī)

5、則、結(jié)構(gòu)均勻而完整，沒有明顯細(xì)胞和核物質(zhì)的殘留，且透光性能好、機械性能好，與正常豬角膜無顯著差異，表明本文制備所得脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)符合作為組織工程人角膜基質(zhì)載體支架的條件和要求，可用于組織工程人角膜基質(zhì)的體外重建研究。
　　在利用人角膜基質(zhì)細(xì)胞檢測脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)的生物相容性之前，本文首先利用生長曲線、染色體標(biāo)本制做和免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)對第15代人角膜基質(zhì)細(xì)胞的生長特性、核型、標(biāo)志蛋白和功能蛋白的表達(dá)進行了檢測和鑒定。檢測和鑒定結(jié)果

6、發(fā)現(xiàn)，第15代人角膜基質(zhì)細(xì)胞的生長分裂狀態(tài)良好，群體倍增時間為43.57h，其特征性染色體數(shù)目為46條，保持有波形蛋白（人角膜基質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志性蛋白）的陽性表達(dá)，并具有細(xì)胞連接蛋白間隙連接蛋白-43和整聯(lián)蛋白β1的陽性表達(dá)，以及膜運輸載體蛋白——鈉鉀泵和鈣泵及乙醛脫氫酶的陽性表達(dá)，證明第15代人角膜基質(zhì)細(xì)胞具有正常人角膜基質(zhì)細(xì)胞的屬性和發(fā)揮正常細(xì)胞功能的潛能，符合作為組織工程人角膜基質(zhì)種子細(xì)胞的條件和要求，可用于組織工程人角膜基質(zhì)的體外重建

7、研究。
　　在獲得脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)和人角膜基質(zhì)細(xì)胞的基礎(chǔ)上，本文采用微量注射技術(shù)將第15代人角膜基質(zhì)細(xì)胞接種到脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)中，利用MTT法和免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)對脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)與人角膜基質(zhì)細(xì)胞的生物相容性進行了鑒定研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)載體支架的浸提液對第15代人角膜基質(zhì)細(xì)胞沒有細(xì)胞毒性，而接種至載體支架內(nèi)的人角膜基質(zhì)細(xì)胞在接種后1-5d內(nèi)一直保持有波形蛋白以及間隙連接蛋白-43和整聯(lián)蛋白β1的陽性表達(dá)，且在接種后第3

8、d細(xì)胞的形態(tài)、分布和波形蛋白以及間隙連接蛋白-43和整聯(lián)蛋白β1的表達(dá)已經(jīng)十分理想，表明脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)與人角膜基質(zhì)細(xì)胞具有良好的生物相容性，可以用于組織工程人角膜基質(zhì)的體外重建研究。
　　在進行生物相容性研究的基礎(chǔ)上，本文以脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)為載體支架、以非轉(zhuǎn)染第15代人角膜基質(zhì)細(xì)胞為種子細(xì)胞，開展了組織工程人角膜基質(zhì)的體外重建研究，并對所得組織工程人角膜基質(zhì)的形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能蛋白表達(dá)進行鑒定。對于制備所得生物相容性良好的脫細(xì)胞豬角

9、膜基質(zhì)載體支架，利用微量注射技術(shù)接種第15代人角膜基質(zhì)細(xì)胞，放置于含有10％胎牛血清-DMEM/F12培養(yǎng)液的24孔培養(yǎng)板孔中在37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中體外培養(yǎng)3d，獲得體外重建的組織工程人角膜基質(zhì)。石蠟切片HE染色、免疫細(xì)胞化學(xué)、透射電鏡等的鑒定結(jié)果顯示，體外重建的組織工程人角膜基質(zhì)的形態(tài)結(jié)構(gòu)與活體人角膜相似，其種子細(xì)胞仍保持有波形蛋白、整聯(lián)蛋白β1、間隙連接蛋白-43、乙醛脫氫酶、鈉鉀泵和鈣泵的1陽性表達(dá)，表明體外重建的組織工程人角膜

10、基質(zhì)與活體人角膜基質(zhì)不僅形態(tài)結(jié)構(gòu)相似，還保持有執(zhí)行人角膜基質(zhì)功能的潛能。
　　為了驗證體外重建的組織工程人角膜基質(zhì)是否具有正常的生物學(xué)功能，本文又選用新西蘭兔和比格犬對組織工程人角膜基質(zhì)進行了板層角膜基質(zhì)移植實驗，并利用裂隙燈顯微鏡、角膜測厚儀和眼壓計對移植動物角膜的的透明度、角膜厚度和眼壓進行了跟蹤監(jiān)測。結(jié)果表明，術(shù)后20d，新西蘭兔術(shù)眼角膜保持透明，角膜無感染，無新生血管。利用石蠟切片HE染色、免疫細(xì)胞化學(xué)、透射電鏡等技術(shù)對移

11、植兔眼進行了離體鑒定，HE染色結(jié)果顯示組織工程人角膜基質(zhì)植片與植床愈合情況良好；熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示植片上有DiI標(biāo)記的人角膜基質(zhì)細(xì)胞定位，透射電鏡結(jié)果顯示重建的組織工程人角膜基質(zhì)中膠原纖維排列緊密規(guī)則，人角膜基質(zhì)細(xì)胞伸展其間，并且與支架形成了細(xì)胞連接。免疫熒光染色結(jié)果顯示，標(biāo)志蛋白-波形蛋白，功能蛋白-間隙連接蛋白-43、整聯(lián)蛋白β1、鈉鉀泵、鈣泵和乙醛脫氫酶的表達(dá)均呈陽性，說明人角膜基質(zhì)細(xì)胞移植入體內(nèi)后有發(fā)揮生物學(xué)功能的潛能。比格

12、犬角膜移植實驗結(jié)果表明，移植早期比格犬術(shù)眼角膜角膜輕微水腫，到一個月時，角膜逐漸透明，術(shù)后120d，比格犬術(shù)眼角膜保持透明，角膜無感染，無新生血管，至今仍在跟蹤觀察。移植眼角膜厚度和眼壓與對照眼相比，無顯著差異。上述動物移植結(jié)果表明，本文體外重建所得組織工程人角膜基質(zhì)在植入動物眼上以后能發(fā)揮生物學(xué)功能，有望作為捐獻(xiàn)角膜的替代物用于角膜基質(zhì)病盲患者的臨床角膜移植和治療，動物移植實驗的成功為臨床實驗研究奠定了基礎(chǔ)。
　　綜上所述，本文