家蠶表達(dá)霍亂毒素B亞基與人胰島素或胰島素B鏈融合蛋白及其抗自身免疫性糖尿病的研究.pdf

1、Ⅰ型糖尿病由胰島素分泌缺陷產(chǎn)生，它是一種針對(duì)胰島β細(xì)胞的自身免疫性疫病。在疾病發(fā)展過(guò)程中，胰島素及其前體、谷氨酸脫羧酶(GAD)、熱休克蛋白(HSP60)等多種自身抗原被T細(xì)胞識(shí)別，產(chǎn)生自身免疫反應(yīng)并導(dǎo)致胰島損傷。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明通過(guò)口服一種自身抗原，如胰島素或GAD，即誘導(dǎo)了免疫耐受，產(chǎn)生了保護(hù)作用，進(jìn)而抑制糖尿病的發(fā)生。 1.口服家蠶表達(dá)CTB與胰島素融合蛋白對(duì)治療自身免疫性糖尿病的研究 口服疾病特異性自身抗原能誘導(dǎo)口服

2、免疫耐受，并能有效延緩或抑制自身免疫性疾病癥狀的發(fā)生。在體內(nèi)成功誘導(dǎo)免疫耐受需要長(zhǎng)期口服大量的蛋白抗原，霍亂毒素B亞基(CTB)可作為誘導(dǎo)口服耐受的強(qiáng)大粘膜運(yùn)載系統(tǒng)，自身抗原通過(guò)與CTB蛋白偶聯(lián)可極大地較少口服自身抗原的劑量。這些都暗示CTB偶聯(lián)自身抗原不僅使口服耐受防治Ⅰ型糖尿病等自身免疫性疫病更具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，而且還有潛在的治療前景。 在本研究中我們構(gòu)建了CTB與人胰島素融合基因，并在家蠶中得到高效表達(dá)，融合蛋白(20kD

3、a)在家蠶幼蟲(chóng)的蠶血淋巴中表達(dá)量達(dá)到0.3mg/ml。經(jīng)檢測(cè)，該融合蛋白在家蠶中以五聚體形式存在，并且保持GM1神經(jīng)節(jié)苷脂的受體結(jié)合特性以及CTB和胰島素的抗原性。非肥胖性糖尿病(NOD)小鼠經(jīng)口服含微克級(jí)的CTB與胰島素融合蛋白的蠶血淋巴，病理組織切片實(shí)驗(yàn)表明胰島發(fā)炎程度顯著減輕。適時(shí)監(jiān)測(cè)血糖的實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦表明糖尿病的病理癥狀得到明顯延緩，過(guò)繼轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)亦表明口服該融合蛋白產(chǎn)生了潛在的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞從而抑制糖尿病的發(fā)生。這些結(jié)果表明家蠶生物

4、反應(yīng)器是一個(gè)合適的生產(chǎn)口服疫苗系統(tǒng)，并通過(guò)該系統(tǒng)誘導(dǎo)針對(duì)T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫疾病的免疫耐受，該研究是利用我國(guó)自身蠶業(yè)資源優(yōu)勢(shì)研制抗Ⅰ型糖尿病口服疫苗，為Ⅰ型糖尿病的治療開(kāi)辟了新的途徑。 2.部分多角體同源序列對(duì)外源基因在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的影響分析 目前家蠶桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)(BEVS)已被廣泛用來(lái)高效表達(dá)外源基因，但在很多情況下，昆蟲(chóng)細(xì)胞或幼蟲(chóng)表達(dá)的重組蛋白量不夠，不能滿足實(shí)驗(yàn)需要。因此，需要一些新的技術(shù)和方法來(lái)

5、提高外源蛋白在桿狀病毒系統(tǒng)中的表達(dá)水平。 本研究在CTB與胰島素融合基因(CTB-INS)的5’端融合了部分來(lái)自多角體基因的5’非編碼區(qū)(ATAAAT)和編碼區(qū)(ATGCCGAAT)共15bp的核酸序列，因此與原CTB-INS融合蛋白相比，經(jīng)過(guò)修飾的融合蛋白(mCTB-INS)在其N(xiāo)末端增加了兩個(gè)氨基酸Pro-Asn。我們將新的融合蛋白mCTB-INS在家蠶細(xì)胞和幼蟲(chóng)中分別表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)由于融合了部分多角體同源序列(PPHS)，

6、新的蛋白的表達(dá)量與原CTB-INS蛋白相比提高了近4倍。進(jìn)一步分析得知，新蛋白N端增加的兩個(gè)氨基酸并未顯著影響其與GM1神經(jīng)節(jié)苷脂的結(jié)合能力。因此，本實(shí)驗(yàn)中所使用的15bp多角體同源序列可被用作為一個(gè)結(jié)構(gòu)元件，在多角體啟動(dòng)子下游促進(jìn)外源基因的表達(dá)。 3.口服家蠶表達(dá)CTB與胰島素B鏈融合蛋白對(duì)治療糖尿病的研究 選擇胰島素B鏈作為自身抗原是由于B鏈包含了胰島素的主要抗原決定族，而這些抗原決定族與自身免疫性糖尿病的發(fā)展極其相

7、關(guān)，僅僅口服胰島素B鏈在動(dòng)物模型中同樣能抑制糖尿病的發(fā)生，其效果與口服胰島素完整蛋白相近。 在本研究中我們構(gòu)建了CTB與人胰島素B鏈融合基因，并在家蠶中得到高效表達(dá)，融合蛋白(17kDa)在家蠶幼蟲(chóng)的蠶血淋巴中表達(dá)量達(dá)到0.97毫克/毫升。經(jīng)檢測(cè)，該融合蛋白在家蠶中以五聚體形式存在，并且保持GM1神經(jīng)節(jié)苷脂的受體結(jié)合特性以及CTB的抗原性。非肥胖性糖尿病小鼠經(jīng)口服含微克級(jí)的CTB與胰島素B鏈融合蛋白的蠶血淋巴，病理組織切片實(shí)驗(yàn)表