家蠶表達的綠色熒光蛋白標記的霍亂毒素B亞基與人胰島素融合蛋白抗1型糖尿病的研究.pdf

1、1型糖尿病(type1 diabetes，T1D)是一種針對胰腺胰島β細胞的自身免疫性疫病，其結(jié)果是導致胰島素分泌缺乏。自身反應性抗體和T淋巴細胞的出現(xiàn)、T細胞介導的疾病過繼轉(zhuǎn)移性以及對免疫抑制治療的敏感性是T1D自身免疫性的集中表現(xiàn)。在該疾病的發(fā)生過程中，胰島素(insulin，Ins)、胰島素其前體、谷氨酸脫羧酶等是其主要自身抗原。
　　 1口服家蠶表達的綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GF

2、P)標記的霍亂毒素B亞基(cholera toxin B subunit，CTB)與人胰島素融合蛋白治療1型糖尿病的研究
　　 口服一種疾病特異的自身抗原可誘導機體對該疾病產(chǎn)生免疫反應的耐受，從而抑制或延緩該自身免疫性疾病的發(fā)展。在機體內(nèi)有效誘導免疫耐受需要長期的口服大劑量的特異蛋白抗原，而CTB是誘導口服免疫耐受的強有力的粘膜佐劑分子，可開發(fā)用來偶聯(lián)抗原蛋白大大減少抗原蛋白的口服耐受誘導使用劑量，提示CTB偶聯(lián)自身抗原Ins誘

3、導口服耐受防治T1D可能具有實際的治療意義和潛在的應用前景。
　　 在本研究中我們構建了GFP標記的CTB與人Ins融合基因，并利用Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)在家蠶中高效表達該蛋白，該融合蛋白(48kDa)在家蠶幼蟲的血淋巴中表達量達到0.58mg/ml。經(jīng)驗證，該融合蛋白在家蠶中以五聚體形式存在，并且保持與神經(jīng)節(jié)苷脂GM1的結(jié)合特性以及CTB和Ins的抗原性。非肥胖性糖尿病(non-obese diabetes，NO

4、D)小鼠口服微克級的含此融合蛋白的蠶血淋巴，胰腺的組織病理切片顯示胰島發(fā)炎程度顯著減輕，適時監(jiān)測血糖的實驗結(jié)果亦表明T1D的發(fā)病明顯延緩。這些結(jié)果表明家蠶生物反應器是一個理想的口服疫苗生產(chǎn)體系，并且口服通過該生產(chǎn)體系表達的蛋白可誘導對T細胞介導的某些自身免疫疾病的耐受，在該方向上的科學研究利用我國自身蠶業(yè)資源的優(yōu)勢探索T1D的口服治療疫苗，為T1D的治療提供了新的切入點。
　　 2.口服胰島素治療T1D的作用機制與特異性調(diào)節(jié)性T

5、(regulatory T，Treg)細胞的相關性研究
　　 粘膜誘導的免疫耐受在治療自身免疫性疾病中極具發(fā)展前景。文獻報道，通過鼻腔粘膜，舌下腺或小腸粘膜誘導的特異性耐受與Treg細胞有關，尤其在小腸內(nèi)抗原蛋白經(jīng)由樹突狀細胞提呈給免疫細胞，可能誘導出適合Treg產(chǎn)生的環(huán)境，通過抗原特異性Treg細胞的誘導發(fā)揮免疫抑制作用，相類似的作用在腫瘤浸潤過程中也得到證實。
　　 在本實驗研究中，我們構建的GFP標記的CTB與人I

6、ns融合蛋白與本實驗室已有的CTB-INS融合蛋白均可誘導Ins特異的口服耐受。利用GFP標簽我們追蹤到融合蛋白可與小腸粘膜發(fā)生特異性結(jié)合。在小鼠血液中，我們檢測到抗CTB、Ins的特異抗體亞型IgG1抗體水平升高，同時脾臟、小腸淋巴結(jié)、血液中CD4+CD25+Foxp3+T細胞與對照組相比顯著增加。而脾臟淋巴細胞的增值和遷移能力受到抑制提示此融合蛋白誘導的口服耐受與特異性Treg的產(chǎn)生相關。NOD/SCID小鼠過繼轉(zhuǎn)移實驗表明口服耐受