雞IgY輕鏈可變區(qū)（ScV-,L-）基因T7 PDT文庫構(gòu)建.pdf

1、雞的免疫球蛋白(Immunoglobulin，Ig)有三種：IgY、IgM和IgA。IgY與哺乳動(dòng)物IgG的抗病功能相同，但結(jié)構(gòu)上存在差異，IgY重鏈上沒有鉸鏈結(jié)構(gòu)。IgY由兩條重鏈(HeavyChain，H)和兩條輕鏈(LightChain，L)構(gòu)成。各有一個(gè)可變區(qū)(VariableRegion，V)位于H和L的N端，稱為VH和VL。與抗原表位(Epitope)特異結(jié)合的區(qū)域就位于V上，由VH和VL的三個(gè)抗原互補(bǔ)決定區(qū)(Complem

2、entarity-determiningregions，CDR)共同形成。研究表明，編碼IgYVL的基因是Vλ-Jλ。雞IgYL的多樣性是在雞法氏囊發(fā)育期間依靠基因轉(zhuǎn)換(Geneconversion)形成。以后在抗原刺激下發(fā)生體細(xì)胞多樣化(SomaticDiversiflcation)而獲得高親和力(Affinity)。 雞與哺乳動(dòng)物進(jìn)化距離大。因此雞對哺乳動(dòng)物體內(nèi)的抗原物質(zhì)容易產(chǎn)生強(qiáng)免疫應(yīng)答，產(chǎn)生出針對哺乳動(dòng)物細(xì)胞抗原的高親和

3、力IgY。雞血清中的IgY先轉(zhuǎn)移到蛋黃中儲(chǔ)存，胚胎發(fā)育時(shí)又從蛋黃中進(jìn)入雞胚血液。利用多次免疫接種技術(shù)可以獲得高效價(jià)特異IgY的高免雞蛋，可以采用生化技術(shù)從中制備大量的純IgY。許多研究證明，雞IgY特異性高，親和力可與鼠源單抗媲美，穩(wěn)定性好(在70℃以下和pH4以上活性穩(wěn)定)。高免雞蛋生產(chǎn)簡便，批量大，無須采血，符合動(dòng)物福利。因此，利用蛋雞大量生產(chǎn)特異IgY的技術(shù)(IgYTechnology)倍受重視，已有產(chǎn)品上市。 雞IgY技

4、術(shù)存在不足之處。(1)雞病太多，尤其禽流感等人禽共患病給雞IgY產(chǎn)品安全性帶來了影響，專家們呼吁要用SPF雞生產(chǎn)IgY。不難想象，其成本很高，在動(dòng)物藥品市場上缺乏競爭力。(2)抗原量大(多次免疫)，有些抗原對雞群健康有危害。(3)雞IgY具有強(qiáng)抗原性，在哺乳動(dòng)物上應(yīng)用時(shí)受抗抗體和血清病影響，難以發(fā)揮作用。 McCafferty(1990)首次報(bào)道出利用PDT構(gòu)建抗體基因文庫。由于抗體蛋白表達(dá)于噬菌體的表面，采用抗原抗體特異結(jié)合的

5、親和淘洗技術(shù)可以獲得抗體基因的重組噬菌體克隆。從這些克隆中提取抗體基因可以在酵母細(xì)胞中高效表達(dá)和工業(yè)化生產(chǎn)。重組噬菌體技術(shù)能有效的模仿免疫多樣性和選擇性的特征，能很容易的通過測序、突變和篩選來提高重組噬菌體抗體對抗原的結(jié)合力，無限量的合成和表達(dá)實(shí)際上可針對任何抗原的抗體分子。因此，本研究的目的就是利用噬菌體表面展示技術(shù)構(gòu)建一個(gè)雞單鏈抗體基因文庫，這為快速研制新抗體奠定基礎(chǔ)。 研究方法：(1)根據(jù)Genbank報(bào)道的雞IgYVλ框

6、架區(qū)(Framework，F(xiàn)R)FR1和FR4設(shè)計(jì)VH、VL的上下游引物，并引入克隆位點(diǎn)；設(shè)計(jì)親水性的(Gly4Ser)3多肽DNA接頭(Linker)；(2)從8周齡雞脾臟中提取總RNA，以O(shè)ligo(dT)為引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，作為模版，在VH、VL上下游引物作用下PCR擴(kuò)增獲得VH和VL基因，利用重疊(Overlap)PCR將VH和VL通過人工合成的Linker連接成VH-Linker-VL，即ScFv基因；(3)通過SacI

7、和NotⅠ酶切重組入T7select10-3b中，經(jīng)體外包裝后轉(zhuǎn)染E.coliBLT5403株即獲得雞ScFv基因T7PDT文庫；(4)通過噬菌斑計(jì)數(shù)庫容量，任取6個(gè)噬菌斑進(jìn)行PCR鑒定，純化PCR產(chǎn)物，測序，并與Genbank中雞IgY基因序列比對。(5)選擇4種抗原進(jìn)行生物淘洗；(6)AIV和GPV兩種抗原生物淘洗陽性克隆噬菌體液進(jìn)行ELISA競爭阻斷試驗(yàn)；(7)抗GPVScVL亞克隆到表達(dá)載體pET28b(+)中，轉(zhuǎn)染Tuner進(jìn)

8、行誘導(dǎo)表達(dá)，純化表達(dá)蛋白，采用競爭ELISA檢測表達(dá)蛋白的抗體活性。 研究結(jié)果：(1)意外獲得雞IgY輕鏈可變區(qū)基因PDT文庫，命名為雞IgY單輕鏈抗體可變區(qū)(Singlechainoflightvariableregion，ScVL)基因T7PDT文庫。測得庫容為4.5×106pfu，ScVL片段大小為450bp；(2)ScVL序列包含有雞IgYVL基因、Linker序列、未知序列(27bp)及重鏈可變區(qū)上游H5引物序列。(3

9、)AIV和GPV抗原生物淘洗均獲陽性克隆ScVL/AIV和ScVL/GPV，四輪淘洗后噬菌斑回收率分別增加了1639和61倍。(4)ScVL/AIV和ScVL/GPV噬菌體培養(yǎng)液ELISA競爭阻斷試驗(yàn)的抑制率分別為17.6﹪和14.6﹪。(5)ScVL/GPV克隆在E.coliTuner中表達(dá)產(chǎn)物為可溶性蛋白質(zhì)，分子量為23kD，競爭ELISA檢測抑制率達(dá)到28﹪，說明GPVScVL具有抗體親和性。 結(jié)論：構(gòu)建起了雞IgYScV