表達(dá)ILTV gB及gD主要抗原表位基因和雞IgY重鏈恒定區(qū)基因重組雞痘病毒免疫效力的研究.pdf

1、南京農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文表達(dá)ILTVgB及gD主要抗原表位基因和雞IgY重鏈恒定區(qū)基因重組雞痘病毒免疫效力的研究姓名：劉文波申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師：陳溥言20051201表達(dá)IuVgB及gD主要抗原表位基因和雞lgY重鏈恒定區(qū)肇因重組鴆瘟病毒免疫效力的研究pMDl8T載體中進(jìn)行序列測(cè)定。結(jié)果表明，ILTVgE基因包括1個(gè)1500bp的完整開放閱讀框架，可編碼499個(gè)氨基酸組成的多肽。將ILTV煙臺(tái)株的gE基因和gE蛋

2、白分別與ILTv美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)攻毒毒株和中國(guó)王崗株、BHVl、EHV1、FHVl、HHv2、HHV3、HVT、MDV1、MDV2和PRV的gE基因和gE蛋白比較，發(fā)現(xiàn)它們之間gE基因的核苷酸和gE蛋白氨基酸的同源性分別在997％～119％和994％～15％之間。表明不同ILTV毒株之間，gE基因還是比較保守的，但不同疤疹病毒之間，gE基因的同源性比較低。氨基酸序列分析表明，ILTVgE蛋白屬典型的I型膜蛋白，具有與其他Ⅱ皰疹病毒gE蛋白相似的

3、排列與結(jié)構(gòu)。同時(shí)，在IuV旺蛋白相應(yīng)位置還發(fā)現(xiàn)了其他Q皰疹病毒薛蛋白均有的5個(gè)保守的Cys殘基及2個(gè)保守的特征性氨基酸殘基基序(YXXL)。這一切表明，ILTvgE蛋白可能和其他旺皰疹病毒gE蛋白具有一些相似的生物學(xué)功能。3目的片段的選取及重組雞痘病毒轉(zhuǎn)移載體pEFgBgD和pEF—gBgD—lgY的構(gòu)建以傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)3哐I臺(tái)株基因組DNA為模板，根據(jù)已發(fā)表的ILTVSA2株基因序列設(shè)計(jì)并合成2對(duì)引物，分別擴(kuò)增其gB和

4、gD的主要抗原表位基因，同時(shí)人工合成IgY重鏈恒定區(qū)第900～1400基因。在gB上游引物5’端添加ATOGCG，gD上游引物5’端設(shè)計(jì)一個(gè)9個(gè)氨基酸的linker(GSLAGALGL一)，在合成的IgY重鏈恒定區(qū)基因3’端添加1’AA，使gB及gD主要抗原表位基因與IgY重鏈恒定區(qū)基因／94i后形成一個(gè)完整的閱讀框架。將gB和gD片段分別亞克隆到pBluescriptIISK()中，得到重組質(zhì)粒pSK—gBgD。同時(shí)利用Primer5

5、0軟件設(shè)計(jì)并合成1對(duì)引物，擴(kuò)增串聯(lián)的gB和gD主要抗原表位基因片段。在卵gD下游引物中添加TAA，以使gB—gD基因片段形成一個(gè)完整的閱讀框架，然后再將從重組質(zhì)粒pSKgB—gD酶切回收得到的gB—gD基因片段和人工合成的IgY重鏈恒定區(qū)片段及PCR擴(kuò)增得到的gB—gD基因片段分別亞克隆到雞痘病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒載體pEFgptl2s中。經(jīng)酶切分析和PCR鑒定，表明已成功構(gòu)建了重組雞痘病毒轉(zhuǎn)移載體pEFgB—gD和pEF—gB—gD—IgY，為

6、進(jìn)一步在細(xì)胞中轉(zhuǎn)染并獲得表達(dá)傳染性喉氣管炎病毒班及gD主要抗原表位基因和雞IgY重鏈恒定區(qū)基因的重組雞痘病毒奠定了基礎(chǔ)。4目的片段在重組雞痘病毒中的表達(dá)及重組病毒生物學(xué)特性的研究1ffl脂質(zhì)體法，將構(gòu)建好的重組雞痘病毒轉(zhuǎn)移載體pEF—gB—gD和pEF—gB—gD—IgY轉(zhuǎn)染已感染雞痘病毒282E4疫苗株2h的次代雞胚戍纖維細(xì)胞，待出現(xiàn)明顯病變后收毒，用藥物篩選培養(yǎng)基(MXHAT)在24孔板上進(jìn)行連續(xù)篩選純化，得到重組病毒rFPVgBg