雙鏈DNA分子中單個(gè)錯(cuò)配堿基對(duì)自發(fā)翻轉(zhuǎn)的動(dòng)力學(xué)研究.pdf

1、在生物物理科學(xué),尤其是生物大分子或生物系統(tǒng)之動(dòng)力學(xué)機(jī)制研究中所發(fā)現(xiàn)的越來(lái)越多的隨機(jī)過(guò)程(現(xiàn)象)迅速更新和豐富著人們對(duì)于復(fù)雜生命科學(xué)之認(rèn)識(shí)。在對(duì)這些隨機(jī)現(xiàn)象探索的過(guò)程中,單分子探測(cè)技術(shù)逐漸發(fā)展成為最有利的研究工具之一。單分子探測(cè)最核心之思想在于追蹤并記錄每一個(gè)單個(gè)生物分子之動(dòng)態(tài)行為,以便獲得更豐富更細(xì)致的具有統(tǒng)計(jì)意義的動(dòng)力學(xué)和動(dòng)態(tài)學(xué)信息?；谶@個(gè)核心思想,科學(xué)家們發(fā)展了用于在熱平衡系統(tǒng)中采集反映單個(gè)生物大分子動(dòng)態(tài)行為的熒光漲落譜——熒光相

2、關(guān)光譜技術(shù)。科學(xué)家對(duì)采集到的熒光漲落信號(hào)進(jìn)行自/互相關(guān)(協(xié)方差)分析,從而從中獲得期望的反映生物大分子動(dòng)態(tài)行為之熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。然而,在復(fù)雜生動(dòng)的生命科學(xué)面前,再?gòu)?qiáng)大的檢測(cè)工具也是不完美的,包括單分子探測(cè)和熒光相關(guān)光譜技術(shù)。
　　DNA/RNA分子中諸如堿基的甲基化、去甲基化、羥基化等過(guò)程的DNA/RNA分子堿基修飾/修復(fù)過(guò)程,因其在表觀遺傳學(xué)中之重要意義而越來(lái)越多地受到人們之重視和興趣。人們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)有很多蛋白在修復(fù)或修飾目標(biāo)

3、堿基的過(guò)程中都采用將目標(biāo)堿基翻轉(zhuǎn)出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)之機(jī)制。然而,針對(duì)目標(biāo)堿基怎樣從雙螺旋結(jié)構(gòu)內(nèi)部翻轉(zhuǎn)出去這一問(wèn)題,并沒(méi)有明確的答案,而其中最核心之問(wèn)題則在于待修復(fù)的目標(biāo)堿基(受損傷堿基或錯(cuò)配堿基)能否因其為非Watson-Crick堿基對(duì)而自發(fā)翻轉(zhuǎn)出DNA雙螺旋,并作為動(dòng)力學(xué)信號(hào)被修復(fù)蛋白識(shí)別并且捕獲。這一核心問(wèn)題得以遺留至今,其主要技術(shù)難點(diǎn)在于,堿基翻轉(zhuǎn)之空間變化非常小,且翻轉(zhuǎn)行為之動(dòng)力學(xué)弛豫時(shí)間尺度在當(dāng)前主流檢測(cè)手段之盲區(qū),因此很難

4、利用現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)手段獲取其自發(fā)翻轉(zhuǎn)動(dòng)力學(xué)信息。人們?cè)噲D利用核磁共振譜學(xué)和基于快速混合的非平衡態(tài)實(shí)驗(yàn)體系來(lái)研究單個(gè)堿基翻轉(zhuǎn)的動(dòng)態(tài)行為,但終究因技術(shù)限制而未能得到準(zhǔn)確的令人滿意的結(jié)果。
　　針對(duì)上述提到的錯(cuò)配堿基能否自發(fā)翻轉(zhuǎn)且如何精確探測(cè)堿基自發(fā)翻轉(zhuǎn)動(dòng)態(tài)行為之問(wèn)題,本文對(duì)熒光相關(guān)光譜技術(shù)進(jìn)行了擴(kuò)展并發(fā)展出降速擴(kuò)散的熒光相關(guān)光譜這一技術(shù)。本論文首先介紹了研究堿基自發(fā)翻轉(zhuǎn)動(dòng)力學(xué)之目的及其重要意義,以及針對(duì)該問(wèn)題的當(dāng)前國(guó)內(nèi)外的研究進(jìn)展。其次

5、,將簡(jiǎn)單介紹單分子技術(shù),尤其是熒光相關(guān)光譜技術(shù)之基本原理和一些簡(jiǎn)單應(yīng)用。隨后基于之前介紹的熒光相關(guān)光譜的基本原理,將主要介紹本文從理論及實(shí)驗(yàn)兩方面對(duì)共擴(kuò)散的多個(gè)熒光基團(tuán)的熒光相關(guān)光譜之研究。該研究表明,在共擴(kuò)散的多個(gè)熒光基團(tuán)體系的熒光相關(guān)光譜中,由熒光基團(tuán)本身光物理性質(zhì)或其他化學(xué)反應(yīng)導(dǎo)致的相關(guān)光譜的衰減之振幅,與其共擴(kuò)散的熒光基團(tuán)之?dāng)?shù)目成反比關(guān)系。
　　然后,本論文將介紹作者對(duì)降速擴(kuò)散熒光光譜技術(shù)之開(kāi)發(fā)和研究。為了減緩待測(cè)分子自由

6、擴(kuò)散之速度,作者將待測(cè)分子鏈接于直徑為微米級(jí)的聚丙烯小球之上,并成功使得待測(cè)分子在小球之“拖拽”作用下,于共聚焦區(qū)域的特征停留時(shí)間延長(zhǎng)至約1秒鐘之久,足以用來(lái)探測(cè)動(dòng)力學(xué)弛豫從亞毫秒到幾十毫秒數(shù)量級(jí)的化學(xué)反應(yīng)或構(gòu)象動(dòng)態(tài)學(xué)變化。另外在這一部分,還將以DNA發(fā)卡分子之折疊動(dòng)力學(xué)為模型體系,對(duì)所開(kāi)發(fā)的降速擴(kuò)散熒光相關(guān)光譜可用性進(jìn)行了測(cè)試和論證。通過(guò)降速擴(kuò)散熒光相關(guān)光譜,本文第一次同時(shí)捕獲到多個(gè)折疊中間態(tài)和最終折疊態(tài)的動(dòng)力學(xué)弛豫過(guò)程,為之前的理論

7、預(yù)言提供了可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　最后,本論文對(duì)錯(cuò)配堿基對(duì)自發(fā)翻轉(zhuǎn)動(dòng)力學(xué)之研究進(jìn)行了詳細(xì)闡述。利用之前開(kāi)發(fā)的降速擴(kuò)散熒光相關(guān)光譜,作者發(fā)現(xiàn),相比正常的Watson-Crick堿基對(duì),錯(cuò)配的堿基對(duì)有一定幾率自發(fā)翻轉(zhuǎn)出DNA分子雙螺旋結(jié)構(gòu),并在其雙螺旋外的位置停留約幾毫秒之久,為蛋白識(shí)別目標(biāo)堿基以及堿基翻轉(zhuǎn)分子機(jī)制之研究提供了重要的動(dòng)力學(xué)依據(jù)。另外作者的實(shí)驗(yàn)還表明, T-T錯(cuò)配相比T-G錯(cuò)配而言,其在雙螺旋內(nèi)之結(jié)構(gòu)相對(duì)更不穩(wěn)定,這也與之