細(xì)胞體內(nèi)分離鑒定RNA結(jié)合蛋白結(jié)合的靶mRNA技術(shù)的建立和驗(yàn)證.pdf

1、轉(zhuǎn)錄后水平的基因表達(dá)調(diào)控是細(xì)胞生長和分化過程中最重要的調(diào)節(jié)機(jī)制之一。轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控會(huì)影響很多基因的蛋白表達(dá)水平和細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)的特定位置，從而影響細(xì)胞的分化方向。RNA結(jié)合蛋白是轉(zhuǎn)錄后水平基因表達(dá)調(diào)控的主要承擔(dān)者。RNA結(jié)合蛋白(RNA-bindingprotein，RBP)多具有保守的RNA結(jié)合模體(RNA-bindingmotifs，RBM)，其所結(jié)合的靶RNA也多具有特異結(jié)構(gòu)或序列，RNA結(jié)合蛋白通過RNA結(jié)合模體來特異地與靶R

2、NA的特異結(jié)構(gòu)或序列結(jié)合，進(jìn)而調(diào)節(jié)這些RNA的剪輯、運(yùn)輸、穩(wěn)定性和翻譯等。體內(nèi)分離和鑒定RNA結(jié)合蛋白的核糖核蛋白復(fù)合體已成為基因組后時(shí)期的一個(gè)具有重要意義的挑戰(zhàn)。 本工作建立了一種能夠全景式分離鑒定RNA結(jié)合蛋白靶mRNA的技術(shù)平臺(tái)。本技術(shù)平臺(tái)的路線是：分別構(gòu)建生物素連接酶(BirA)基因、可生物素化多肽標(biāo)簽(BAP)-RNA結(jié)合蛋白融合基因的真核表達(dá)載體。共轉(zhuǎn)染上述真核表達(dá)載體至細(xì)胞內(nèi)使其表達(dá)，在生物素存在的前提下，利用生物

3、素連接酶(BirA酶)使可被生物素化的多肽標(biāo)簽進(jìn)行生物素化，通過StreptavidinSepharose-beads的一步純化，即可獲得與多肽標(biāo)簽融合表達(dá)的RNA結(jié)合蛋白及其靶mRNA，即核糖核蛋白復(fù)合體Ribonucleoprotein，RNP。工作中通過Westernblot方法驗(yàn)證了該項(xiàng)技術(shù)路線的可靠性，表明StreptavidinSepharose-beads的一步純化法可以簡便得到核糖核蛋白復(fù)合體。本工作還通過RT-PCR方