鈣庫(kù)操縱性鈣內(nèi)流抑制劑SKF-96365抗結(jié)腸癌作用及機(jī)制研究.pdf

1、結(jié)腸癌是臨床上常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，當(dāng)前以外科手術(shù)與化療為主的綜合治療效果仍不理想，治療后仍有約50％以上的患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移。因此，尋找新的治療靶點(diǎn)與治療策略以進(jìn)一步改善患者預(yù)后，是目前結(jié)腸癌治療中亟需解決的問(wèn)題。鈣離子（Ca2+)作為重要的第二信使參與調(diào)節(jié)許多細(xì)胞基本生理功能，并與腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移和血管生成等惡性表型密切相關(guān)。細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)的維持依靠細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)Ca2+的釋放與細(xì)胞外Ca2+的內(nèi)流。鈣庫(kù)操縱性Ca2+內(nèi)流(stor

2、e-operated calcium entr，SOCE)是Ca2+進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)的主要方式，靶向SOCE的抑制劑有望成為新的抗腫瘤藥物。SKF-96365是鈣庫(kù)操縱性鈣內(nèi)流抑制劑，能夠明顯抑制非興奮細(xì)胞中的SOCE過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)SKF-96365能夠抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖。目前，SKF-96365在結(jié)腸癌中的抗腫瘤作用及其分子機(jī)制尚不清楚。
　　目的：
　　研究SKF-96365對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的抗腫瘤作用，及對(duì)細(xì)胞周期、凋亡

3、、自噬水平的影響;分析SKF-96365抗腫瘤作用可能的分子機(jī)制及自噬在此過(guò)程中所發(fā)揮的作用;在此基礎(chǔ)上觀察抑制自噬是否增加結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)SKF-96365的敏感性。
　　方法：
　　通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察SKF-96365對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞SOCE過(guò)程的影響;MTS檢測(cè)SKF-96365對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞存活的影響;流式細(xì)胞儀、Western blot等方法觀察SKF-96365對(duì)細(xì)胞周期和凋亡的影響;Western blot、免疫熒

4、光與透射電鏡等方法觀察SKF-96365處理對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)及自噬體形成的影響;抗體芯片及生物信息學(xué)分析SKF-96365處理后結(jié)腸癌細(xì)胞中重要信號(hào)通路的表達(dá)變化情況;MTS方法檢測(cè)，自噬抑制劑或下調(diào)自噬調(diào)控基因Beclin1抑制自噬對(duì)SKF-96365抗腫瘤作用的影響;采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)抑制自噬前后細(xì)胞凋亡率的變化;建立結(jié)腸癌裸鼠移植瘤模型驗(yàn)證自噬抑制劑對(duì)SKF-96365的增敏作用。
　　結(jié)果：
　　SKF-

5、96365能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞株SOCE介導(dǎo)的鈣離子內(nèi)流，并能有效抑制HCT116與HT29細(xì)胞生長(zhǎng)，其機(jī)制在于誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞G2/M期阻滯和凋亡。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)SKF-96365可以誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞自噬，并證實(shí)SKF-96365誘導(dǎo)的自噬先于凋亡發(fā)生。自噬通過(guò)抑制細(xì)胞色素c從線粒體的釋放，從而延緩凋亡的發(fā)生，為細(xì)胞提供保護(hù)。
　　為進(jìn)一步明確SKF-96365誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡及自噬的分子機(jī)制，我們采用抗體芯片檢測(cè)SKF-96365

6、作用前后細(xì)胞內(nèi)主要信號(hào)傳導(dǎo)通路的變化，發(fā)現(xiàn)SKF-96365能夠顯著抑制AKT/mTOR信號(hào)通路。結(jié)合生物信息學(xué)分析，我們預(yù)測(cè)并證實(shí)鈣離子-鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱγ亞型（CaMKⅡγ）在SKF-96365抗腫瘤過(guò)程中起到關(guān)鍵作用，其可以磷酸化AKT S473位點(diǎn)，進(jìn)而激活A(yù)KT/mTOR信號(hào)通路。而AKT/mTOR信號(hào)通路在腫瘤增殖、凋亡及自噬過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。過(guò)表達(dá)CaMKⅡγ或AKT1，可以減弱SKF-96365誘導(dǎo)的腸癌細(xì)胞

7、自噬與凋亡水平。
　　體外研究表明，抑制自噬可以提高SKF-96365對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。不同濃度的SKF-96365聯(lián)合自噬抑制劑CQ或3-MA作用于HCT116和HT29細(xì)胞后，對(duì)其抑制作用顯著高于SKF-96365單藥組，(p＜0.001)。以siRNA Beclin1轉(zhuǎn)染HCT116和HT29細(xì)胞，也能夠顯著提高腫瘤細(xì)胞對(duì)SKF-96365的敏感性。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示與SKF-96365單藥處理相比，聯(lián)合CQ和

8、3-MA時(shí)，細(xì)胞凋亡率顯著增加(p＜0.05)，但對(duì)于SKF-96365誘導(dǎo)的G2/M期阻滯未見明顯作用。
　　裸鼠移植瘤結(jié)果表明自噬抑制劑HCQ可以增加SKF-96365對(duì)HCT116移植瘤的抑制作用。SKF-96365聯(lián)合HCQ組腫瘤體積較對(duì)照組縮小約48.4％，且未觀察到明顯毒性反應(yīng)。與體外研究結(jié)果一致，Western blot與免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，SKF-96365處理組微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)表達(dá)水平明顯升高。SKF

9、-96365聯(lián)合HCQ組較SKF-96365單藥組凋亡更為明顯。同時(shí)我們進(jìn)一步證實(shí)，SKF-96365抑制了腫瘤組織中CaMKⅡγ/AKT/mTOR信號(hào)通路的激活。
　　結(jié)論：
　　SKF-96365能夠明顯抑制結(jié)腸癌細(xì)胞SOCE介導(dǎo)的鈣離子內(nèi)流，從而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)，其機(jī)制是通過(guò)抑制鈣離子/CaMKⅡγ/AKT信號(hào)傳導(dǎo)通路，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯、凋亡與自噬。抑制自噬促進(jìn)SKF-96365在體內(nèi)外對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，提