五氯聯(lián)苯PCB126對(duì)肝癌細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和有氧糖酵解的影響及機(jī)制研究.pdf

1、多氯聯(lián)苯（PCBs）作為一類持久性有機(jī)污染物(POPs)，是一種曾被廣泛用于工業(yè)的鹵代烴類化合物。由于PCBs的不適當(dāng)?shù)奶幚硎沟盟鼈冞M(jìn)入環(huán)境并且不斷積累，對(duì)人類健康造成危害。五氯聯(lián)苯PCB126是一種二噁英類多氯聯(lián)苯（PCB），有較強(qiáng)的毒性。肝癌是一種惡性腫瘤，其發(fā)病率有增長的趨勢。流行病學(xué)調(diào)查表明，肝癌的發(fā)生和PCBs的暴露有一定的聯(lián)系，但 PCBs暴露促進(jìn)肝癌發(fā)病的分子機(jī)制并不清楚。本研究旨在探究五氯聯(lián)苯PCB126暴露對(duì)人肝癌細(xì)胞

2、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）和有氧糖酵解的影響及分子機(jī)制，從而為評(píng)價(jià)PCB126與肝癌發(fā)展的相關(guān)性提供一定的理論依據(jù)。本文的研究包括以下幾部分：
　　第一部分用10-11~10-7 M的PCB126處理肝癌細(xì)胞SMMC-7721和Bel-740224和48 h后，采用qRT-RCR檢測細(xì)胞中EMT關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，通過MTT方法檢測PCB126對(duì)細(xì)胞存活的影響。結(jié)果表明，10-10、10-9和10-8 M PCB126處理細(xì)胞48 h后

3、，EMT的關(guān)鍵蛋白鈣黏著蛋白E-cadherin表達(dá)降低，N-cadherin和波形蛋白Vimentin表達(dá)明顯增加。MTT分析表明PCB126在這些濃度下對(duì)細(xì)胞存活沒有明顯影響。形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，暴露藥物細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生改變。細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)顯示，PCB126暴露導(dǎo)致細(xì)胞間粘附率顯著減少。這些結(jié)果表明PCB126暴露促進(jìn)肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT。
　　第二部分用用10-10、10-9和10-8 M PCB126處理SMMC-7721和Bel-7

4、402細(xì)胞48 h后，檢測細(xì)胞內(nèi)STAT3、p-STAT3和Snail1的水平。結(jié)果表明PCB126暴露提高肝癌細(xì)胞中STAT3和 p-STAT3的蛋白表達(dá)，Snail1 mRNA水平和核內(nèi)的p-STAT3水平。這些結(jié)果表明STAT3/Snail1信號(hào)通路被激活。加入STAT3的抑制劑WP1066后發(fā)現(xiàn)PCB126誘導(dǎo)的EMT被逆轉(zhuǎn)。此外，PCB126處理提高PKM2的表達(dá)并促進(jìn)其核轉(zhuǎn)位。為了進(jìn)一步證明PKM2在STAT3/Sanil1

5、信號(hào)介導(dǎo)的EMT過程中的作用，利用 RNA干擾技術(shù)敲減 PKM2。結(jié)果表明敲減 PKM2明顯抑制 PCB126誘導(dǎo)的p-STAT3的上調(diào)，并且PCB126誘導(dǎo)的細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化被明顯抑制。以上結(jié)果表明PCB126調(diào)控 PKM2激活STAT3/Sanil1信號(hào)通路從而誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT。
　　第三部分用用10-10、10-9和10-8 M PCB126處理SMMC-7721和Bel-7402細(xì)胞48 h后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)芳香烴受體A

6、hR以及其下游基因CYP1A1的mRNA表達(dá)量上調(diào)。為了檢測AhR在PCB126誘導(dǎo)的細(xì)胞EMT中的作用，利用shRNA敲減AhR。結(jié)果表明，AhR敲減后，PCB126暴露引起的PKM2的mRNA和蛋白表達(dá)增加被抑制，STAT3/Snail1信號(hào)通路也被抑制，并且PCB126誘導(dǎo)的EMT被明顯抑制。同時(shí)， PCB126暴露以后細(xì)胞內(nèi)的ROS水平顯著提高。使用ROS抑制劑NAC處理細(xì)胞以后，PCB126暴露激活的PKM2/STAT3/Sn

7、ail1信號(hào)通路和細(xì)胞EMT都被逆轉(zhuǎn)。此外， AhR敲減后，ROS水平也明顯降低。以上結(jié)果表明，PCB126可以通過AhR途徑激活PKM2/STAT3/Snail1信號(hào)通路進(jìn)而誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT。
　　第四部分為了探究雌激素受體ER是否參與到PCB126誘導(dǎo)的細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的過程，用ER的抑制劑ICI182780處理細(xì)胞。結(jié)果表明，清除ER信號(hào)后，細(xì)胞 EMT得到逆轉(zhuǎn)，PKM2的表達(dá)和核轉(zhuǎn)位減少，STAT3/Snail1信

8、號(hào)通路被抑制。以上結(jié)果表明ER參與PCB126暴露引起的肝癌細(xì)胞EMT過程。
　　第五部分為了探討 PCB126對(duì)肝癌細(xì)胞有氧糖酵解的影響和機(jī)制。以SMMC-7721為實(shí)驗(yàn)材料，分別用10-11~10-7M PCB126處理24和48h，利用試劑盒檢測培養(yǎng)基中葡萄糖的含量和乳酸的生成量，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測PKM2和有氧糖酵解通路中關(guān)鍵因子的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn) PCB126暴露明顯減少培養(yǎng)基中葡萄糖含量，提高乳酸的生成量，并且提高

9、PKM2、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1、乳酸脫氫酶和丙酮酸脫氫酶激酶mRNA水平。利用RNA技術(shù)敲減PKM2后PCB126暴露引起的有氧糖酵解得到抑制。這些結(jié)果表明PCB126通過PKM2促進(jìn)細(xì)胞有氧糖酵解。
　　綜上所述，PCB126通過ER和AhR途徑激活PKM2/STAT3/Snail1信號(hào)通路，從而改變EMT關(guān)鍵因子E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的表達(dá)，最終促進(jìn)肝癌細(xì)胞EMT的發(fā)生。此外，PCB126通過