TGF-β1對AGS細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化及體外侵襲的影響.pdf

1、目的：
　　 觀察轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)對人胃癌細(xì)胞株AGS發(fā)生上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)及體外侵襲的影響。
　　 方法
　　 1.將體外正常條件下培養(yǎng)的AGS細(xì)胞用10ng/ml TGF-β1干預(yù),連續(xù)培養(yǎng)3代以后,倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化。
　　 2.分別以1、2、5、10、20、50ng/ml六組終濃度的TGF-

2、β1作用于AGS細(xì)胞,同時設(shè)立空白對照組,連續(xù)培養(yǎng)24小時后,MTT比色法檢測TGF-β1對AGS細(xì)胞增殖的影響。
　　 3.待體外培養(yǎng)的AGS細(xì)胞長到完全融合時,用200μl微量移液槍頭在單層細(xì)胞上垂直劃痕,之后實驗組中加入終濃度為10ng/ml的TGF-β1,每24小時于倒置顯微鏡下觀察劃痕愈合程度,并與對照組進(jìn)行比較。
　　 4.應(yīng)用24孔Transwell侵襲小室進(jìn)行AGS細(xì)胞侵襲試驗,于實驗組中加入終濃度為10

3、ng/ml的TGF-β1,對照組加入等量PBS作為趨化劑,連續(xù)培養(yǎng)24小時,培養(yǎng)結(jié)束后取出Transwell侵襲小室,以4％冰多聚甲醛固定,蘇木素染色,高倍鏡下計數(shù)膜背面上的穿膜細(xì)胞數(shù),與對照組相比較,檢測細(xì)胞運動和侵襲能力的改變。
　　 5.將對數(shù)生長期的AGS細(xì)胞制備細(xì)胞爬片,實驗組加入終濃度為10ng/ml的TGF-β1,48小時后以細(xì)胞免疫熒光方法檢測核轉(zhuǎn)錄因子snail、上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白E-cadherin和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)

4、志蛋白N-cadherin表達(dá)的變化。
　　 6.同時以終濃度為10ng/ml的TGF-β1作用于AGS細(xì)胞48小時后,應(yīng)用Western blot檢測實驗組與對照組中,Snail、E-cadherin和N-cadherin表達(dá)的變化。
　　 結(jié)果
　　 1.AGS細(xì)胞形態(tài)上的改變:TGF-β1誘導(dǎo)AGS向間充質(zhì)細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)化,細(xì)胞失去上皮細(xì)胞的多邊樣形態(tài),表現(xiàn)為類似成纖維細(xì)胞,部分細(xì)胞呈梭形,細(xì)胞的排列較為雜亂,

5、細(xì)胞間的聯(lián)系較為松散。
　　 2.MTT比色法結(jié)果:1、2、5、10ng/ml低濃度的TGF-β1可促進(jìn)細(xì)胞增殖,并且細(xì)胞增殖與TGF-β1的濃度成線性關(guān)系,隨著濃度的增大,細(xì)胞增殖越明顯,且TGF-β1濃度為10ng/ml時促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用最強(qiáng),而20、50ng/ml高濃度的TGF-β1時細(xì)胞增殖比率逐步下降。
　　 3.細(xì)胞劃痕試驗結(jié)果:劃痕后,與對照組相比,加入10ng/ml TGF-β1繼續(xù)培養(yǎng)的實驗組,細(xì)胞遷

6、移能力明顯增強(qiáng)。
　　 4.Transwell侵襲實驗結(jié)果:Transwell小室培養(yǎng)細(xì)胞24h后,AGS細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)為58.33±5.859,實驗組穿膜細(xì)胞數(shù)為105.67±4.041,兩者相比差異具有顯著性(P＜0.05),表示AGS細(xì)胞運動和侵襲能力較對照組大大增強(qiáng)。
　　 5.免疫熒光檢測snail、E-cdaherin和N-cadherin的表達(dá):兔抗人Snail(1:800)加入AGS細(xì)胞,加入特異性山羊抗

7、兔IgG(H+L)/FITC二抗后,熒光顯微鏡下觀察,發(fā)現(xiàn)AGS細(xì)胞核呈現(xiàn)綠色熒光,加入10ng/ml TGF-β1的實驗組與對照組相比較,綠色熒光表達(dá)更強(qiáng)。鼠抗N-cadherin單克隆抗體加入AGS細(xì)胞,加入山羊抗小鼠IgG(H+L)/TRITC標(biāo)記的熒光二抗后,熒光顯微鏡下觀察,發(fā)現(xiàn)AGS細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)紅色熒光,加入10ng/ml TGF-β1的實驗組與對照組相比較,紅色熒光表達(dá)更強(qiáng)。鼠抗E-cadherin單克隆抗體加入AGS細(xì)胞,

8、加入山羊抗小鼠IgG(H+L))/TRITC標(biāo)記的熒光二抗后,熒光顯微鏡下觀察,未檢測出紅色熒光的表達(dá),加入10ng/ml TGF-β1的實驗組亦未檢測出紅色熒光的表達(dá)。
　　 6.Western blot實驗結(jié)果:10ng/ml TGF-β1作用于AGS細(xì)胞后,Snail和N-cadherin的表達(dá)較對照組增多,而E-cdaherin本身表達(dá)微弱,加入TGF-β1后,E-cadherin表達(dá)減少,更加微弱。
　　 結(jié)論