TGF-β經(jīng)典信號通路及相關(guān)基因調(diào)控非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制研究.pdf

1、本文對TGF--β經(jīng)典信號通路及相關(guān)基因調(diào)控非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞上皮--間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制進(jìn)行了研究。本研究分為兩個部分：
　　第一部分：Ski抑制TGF-β/SMAD經(jīng)典信號通路誘導(dǎo)的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和侵襲。
　　目的：上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)是腫瘤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)生的一項(xiàng)關(guān)鍵事件。在此過程中，伴隨著上皮細(xì)胞分子標(biāo)志物E-cadherin的

2、表達(dá)減少和間質(zhì)細(xì)胞分子標(biāo)記物N-cadherin的表達(dá)增多，腫瘤細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，能動性和侵襲能力顯著增強(qiáng)，具有明顯的間充質(zhì)細(xì)胞的特性。在多種癌癥中，TGF-β信號通路都是一個誘發(fā)EMT的關(guān)鍵因素。Ski是TGF-β信號通路的一個重要的負(fù)調(diào)控因子，其可以與SMAD蛋白相互作用來抑制TGF-β信號通路。盡管越來越多的研究證實(shí)Ski在人類多種癌癥中扮演著癌基因或抑癌基因的雙重角色，但是在非小細(xì)胞肺癌中，Ski能否影響TGF-β誘

3、導(dǎo)的EMT和腫瘤細(xì)胞侵潤及其分子機(jī)制還沒有研究進(jìn)行詳細(xì)的闡述。
　　方法：⑴檢測Ski在不同非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株和組織中的表達(dá)；⑵構(gòu)建Ski過表達(dá)和敲弱的A549穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株；⑶在穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株中外源加入TGF-β1，觀察細(xì)胞形態(tài)，Western blot檢測EMT分子標(biāo)記物E-cadherin和N-cadherin，以及p-SMAD3和SMAD3的表達(dá)；⑷構(gòu)建含有PAI-1基因啟動子區(qū)的熒光素酶報告載體轉(zhuǎn)染穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，在外源TGF-β1

4、刺激下，檢測其熒光素酶活性；⑸在外源TGF-β1刺激下，Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)探究Ski對肺癌細(xì)胞侵襲能力的影響;同時real-time PCR檢測MMP-2的表達(dá)。
　　結(jié)果：與非轉(zhuǎn)移性的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株和癌組織相比，Ski在轉(zhuǎn)移性的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞和組織中表達(dá)量是明顯降低的;在外源TGF-β1刺激下，Ski敲弱的A549細(xì)胞株表現(xiàn)出更加明顯的EMT變化和更強(qiáng)的侵襲能力，Ski過表達(dá)的A549細(xì)胞株則相反;Ski敲弱的A5

5、49細(xì)胞株中p-SMAD3的表達(dá)量升高，過表達(dá)的A549細(xì)胞株降低:PAI-1啟動子區(qū)熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)也同樣證實(shí)Ski可以明顯抑制TGF-β1信號通路的活性;當(dāng)用特異性的SMAD3磷酸化抑制劑SIS3預(yù)處理細(xì)胞后，Ski對TGF-β誘導(dǎo)的EMT和細(xì)胞侵襲沒有產(chǎn)生明顯的影響。
　　結(jié)論：Ski抑制TGF-β1誘導(dǎo)的EMT和細(xì)胞侵襲，重要的是Ski的這種作用主要依賴于SMAD經(jīng)典通路。Ski可能為腫瘤的診斷和治療提供新的靶點(diǎn)。

6、r>　　第二部分：非小細(xì)胞肺癌中TGF-β激活的SMAD3/4復(fù)合體轉(zhuǎn)錄調(diào)控N-cadherin表達(dá)的機(jī)制研究。
　　目的：上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)是發(fā)生在腫瘤轉(zhuǎn)移早期階段的關(guān)鍵過程。在多種癌癥類型中，TGF-β信號通路通過抑制上皮標(biāo)志物E-cadheirn的表達(dá)以及上調(diào)間充質(zhì)標(biāo)志物N-cadheirn來促使上皮細(xì)胞發(fā)生EMT。盡管許多的研究致力于E-cadhe

7、rin的表達(dá)調(diào)控，但是在TGF-β介導(dǎo)的EMT發(fā)生過程中，N-cadheirn所受的直接性的轉(zhuǎn)錄調(diào)控卻并不清楚。我們的研究是在TGF-β能夠誘導(dǎo)N-cadheirn表達(dá)的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株中，探討TGF-β調(diào)控N-cadheirn表達(dá)的詳細(xì)的分子機(jī)制。
　　方法：⑴Western blot and qRT-PCR分析在外源TGF-β1刺激下，不同NSCLC細(xì)胞株中N-cadherin的表達(dá)情況；⑵構(gòu)建含有不同N-cadherin基

8、因啟動子區(qū)段的重組質(zhì)粒，鑒定TGF-β1的應(yīng)答效應(yīng)區(qū)域；⑶染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)研究轉(zhuǎn)錄因子與CDH2啟動子區(qū)的結(jié)合；⑷利用RNA干擾實(shí)驗(yàn)分析轉(zhuǎn)錄因子對N-cadherin表達(dá)的影響；⑸在非小細(xì)胞肺癌組織里進(jìn)行相關(guān)性分析。
　　結(jié)果：在A549，SPC-A1和H1650細(xì)胞株中，外源性的TGF-β1都能夠誘導(dǎo)N-cadherin的表達(dá);熒光素酶報告基因分析顯示CDH2-1078/-891啟動子區(qū)段存在TGF-β的應(yīng)答效應(yīng)片段;外源加

9、入TGF-β1，瞬時干擾SMAD3或SMAD4導(dǎo)致CDH2啟動子區(qū)的轉(zhuǎn)錄活性明顯減弱;在A549和SPC-A1細(xì)胞株中，沉默SMAD3或SMAD4明顯抑制CDH2的表達(dá);在非小細(xì)胞肺癌組織中，SMAD3和SMAD4的表達(dá)和CDH2明顯呈正相關(guān)的。
　　結(jié)論：TGF-β活化的SMAD3/4轉(zhuǎn)錄功能復(fù)合體能夠特異性與CDH2啟動子區(qū)的SMAD結(jié)合原件結(jié)合，從而調(diào)控CDH2的表達(dá);我們的研究闡述了TGF-β誘導(dǎo)EMT過程中調(diào)控CDH2表