乙醇對(duì)H4-ⅡE細(xì)胞脂質(zhì)代謝及AMPK表達(dá)的影響.pdf

1、目的：通過(guò)觀察不同濃度乙醇作用于大鼠H4-ⅡE細(xì)胞，探討乙醇對(duì)肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝及其相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。
　　方法：1.細(xì)胞培養(yǎng)將一定量大鼠H4-ⅡE細(xì)胞移至潔凈培養(yǎng)瓶中，根據(jù)細(xì)胞密度加入適量DMEM培養(yǎng)液，于37℃，5％CO2培育箱中培養(yǎng)；2.MTT方法檢測(cè)細(xì)胞活性將梯度濃度乙醇作用于細(xì)胞，作用時(shí)間分別設(shè)立為24 h、48 h、72 h,選擇其中對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)活性有一定影響的乙醇濃度作為實(shí)驗(yàn)濃度（0.2、0.4、0.6 mol/l），實(shí)

2、驗(yàn)時(shí)間設(shè)為24 h；3.細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 HE染色、油紅O染色、AnnexinV-FITC染色、免疫組化染色倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；4.免疫組化方法觀察各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞腺苷酸活化蛋白激酶（AMP--activated protein Kinase，AMPK）及過(guò)氧化物酶體增值物激活受體(Peroxisome Proliferator-activated Receptorα，PPARα)的表達(dá)情況；5. Elisa方法檢測(cè)梯度濃度乙醇作

3、用細(xì)胞12 h、24 h、48 h、72 h后，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞培養(yǎng)上清中AMPK,乙酰輔酶A羧化酶（Acectyl-CoA-Carboxylase，ACC),游離脂肪酸（Free fatty acid，F(xiàn)FA）以及肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶-1（carnitine palmitoyl transferaseI，CPT-1）的分泌量情況；6.Western blotting檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)P-AMPK、PPAR-α、P-ACC、CPT-I的表達(dá)，

4、7.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡情況。
　　結(jié)果：1.MTT一定濃度的乙醇作用H4-ⅡE細(xì)胞后，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)產(chǎn)生明顯的抑制作用，且與作用時(shí)間以及乙醇的濃度密切相關(guān)（P＜0.05）；2.細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，各乙醇實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞呈現(xiàn)出不同程度的凋亡形態(tài)學(xué)變化；3.免疫組化染色結(jié)果同對(duì)照組相比較，0.2、0.4、0.6 mol/l實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞AMPK、PPARα的陽(yáng)性表達(dá)率明顯下降；0.6 mol/l乙醇實(shí)驗(yàn)組AMPK、PP

5、AR-α陽(yáng)性表達(dá)率低于0.4 mol/l組，0.4 mol/l實(shí)驗(yàn)組AMPK、PPAR-α陽(yáng)性表達(dá)率低于0.2 mol/l組（P＜0.05）。4.Elisa結(jié)果在一定的乙醇濃度范圍及作用時(shí)間內(nèi)，乙醇可增加H4-ⅡE細(xì)胞培養(yǎng)上清中ACC,FFA、AMPK及CPT-I的泄漏量（P＜0.05）；其中當(dāng)乙醇濃度在0.1-1.4 mol/l范圍內(nèi)時(shí)，各乙醇實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞AMPK及CPT-I的泄漏量隨著乙醇的濃度增長(zhǎng)作用時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加；而1.6

6、mol/l組AMPK、CPT-I泄漏量（作用時(shí)間48 h、72 h）低于1.4 mol/l組,呈現(xiàn)下降趨勢(shì)；5.Western blotting結(jié)果顯示同對(duì)照組相比較，各乙醇實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞P-AMPK、P-ACC、PPARα及CPT-I蛋白的表達(dá)量明顯下降；隨著乙醇濃度的增長(zhǎng)，各組細(xì)胞P-AMPK、P-ACC、PPARα及CPT-I蛋白的表達(dá)量逐漸下降（0.6 mol/l組＜0.4 mol/l組＜0.2 mol/l組）（P＜0.05）。6.

7、流式細(xì)胞術(shù)①同對(duì)照組相比較，各乙醇實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的凋亡率明顯增加；且0.6 mol/l組凋亡率＞0.4 mol/l組＞0.2 mol/l組（P＜0.05）；②同對(duì)照組相比較，各乙醇實(shí)驗(yàn)組正?；罴?xì)胞數(shù)明顯減少，且0.6 mol/l組＜0.4 mol/l組＜0.2 mol/l組（P＜0.05）；③同對(duì)照組相比較，各乙醇實(shí)驗(yàn)組凋亡細(xì)胞及死亡的細(xì)胞數(shù)顯著增多，且0.6 mol/l組＞0.4 mol/l組＞0.2 mol/l組（P＜0.05）。