炎癥對(duì)不同組織細(xì)胞脂質(zhì)代謝和FAT-CD36表達(dá)影響的研究.pdf

1、第一部分：炎癥對(duì)小鼠脂質(zhì)代謝的影響
　　目的：脂質(zhì)代謝紊亂是指先天性或后天獲得性因素引起血液和組織器官中的脂質(zhì)及其相關(guān)代謝產(chǎn)物的質(zhì)或量的異常。在脂質(zhì)介導(dǎo)的器官損害的機(jī)制研究中，有研究者認(rèn)為胰島素抵抗是其主要因素，而近來(lái)更多的人認(rèn)為慢性炎癥是脂質(zhì)介導(dǎo)的器官損害的中心環(huán)節(jié)。這種炎癥不同于產(chǎn)生“紅腫熱痛”的一般性炎癥，是低豐度系統(tǒng)性慢性炎癥，能夠在機(jī)體與脂質(zhì)共同作用，在許多分子信號(hào)通路參與下引起多種器官的病理?yè)p害及脂質(zhì)代謝相關(guān)疾病的發(fā)生

2、。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)10％的酪蛋白連續(xù)14周皮下注射C57BL/6J小鼠建立慢性炎癥小鼠模型，來(lái)模擬人體的低豐度系統(tǒng)性慢性炎癥狀態(tài)。通過(guò)此炎癥模型，觀察小鼠血液和組織內(nèi)脂質(zhì)含量與分布。
　　方法：從重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心領(lǐng)取53只八周齡的C57BL/6J雄性小鼠，按飲食喂養(yǎng)和處理方式的不同隨機(jī)分為四種：普通飲食組(n=12，NCD)，高膽固醇飲食組(n=12，HCD)，普通飲食+炎癥組(n=14，NCD+Casein)和高膽固醇飲食+炎

3、癥組(n=15，HCD+Casein)。其中高膽固醇飲食含有1.25％膽固醇、0.5％膽酸鹽和21％脂肪，炎癥組的小鼠隔日皮下注射0.5mL的10％的酪蛋白，非炎癥組的小鼠隔日注射等量的生理鹽水，連續(xù)注射14周后處死小鼠，收集小鼠血漿、骨骼肌、脂肪、腎臟等組織，將血漿離心后取上層血清，通過(guò)ELISA測(cè)定各只小鼠血清的炎癥因子SAA和IL-6含量。ELISA法測(cè)定小鼠血清FFA含量，而小鼠的骨骼肌、脂肪、腎臟等組織用于制作冰凍切片和石蠟切

4、片標(biāo)本。將骨骼肌、脂肪、腎臟組織的冰凍切片標(biāo)本進(jìn)行油紅O染色，稱取0.1g組織提取TG和FFA，檢測(cè)經(jīng)過(guò)炎癥干預(yù)后的小鼠骨骼肌、脂肪、腎臟組織的脂質(zhì)水平。
　　結(jié)果：(1)無(wú)論是在普通飲食還是高膽固醇飲食下，Casein注射的小鼠血清SAA和IL-6水平均顯著升高，P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(2)通過(guò)血清FFA水平測(cè)定，與NCD組小鼠比較，NCD+Casein組和HCD組小鼠血清FFA均明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.0

5、5；與HCD組的小鼠比較，HCD+Casein組小鼠血清FFA明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05。(3)各組標(biāo)本進(jìn)行油紅O染色及TG和FFA測(cè)定，與NCD組小鼠比較，HCD組小鼠三種組織脂質(zhì)積聚增加；與HCD組小鼠比較，HCD+Casein組小鼠的骨骼肌和腎臟組織脂質(zhì)異常積聚，脂肪組織的脂質(zhì)無(wú)影響。
　　結(jié)論：皮下注射10％酪蛋白，成功構(gòu)建小鼠炎癥模型，能夠很好模擬人體的低豐度系統(tǒng)性慢性炎癥狀態(tài)。研究表明，當(dāng)一種T淋巴細(xì)胞在

6、肥胖患者內(nèi)臟脂肪聚集時(shí)，可能會(huì)形成脂肪炎癥，進(jìn)而引起代謝綜合征的發(fā)生。通過(guò)小鼠炎癥模型檢測(cè)發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)發(fā)生了脂質(zhì)代謝紊亂，小鼠血清FFA明顯增加，骨骼肌和腎臟組織脂質(zhì)增多，而脂肪組織脂質(zhì)增加不明顯。分析組織間脂質(zhì)分布的差異主要原因是：脂肪組織是慢性炎癥反應(yīng)的靶器官和來(lái)源，炎癥介導(dǎo)脂質(zhì)的積聚首先發(fā)生在脂肪組織，而脂肪組織作為脂肪的儲(chǔ)存器官，能夠代償性的進(jìn)行脂質(zhì)代謝與分布。有研究報(bào)道，低豐度系統(tǒng)性慢性炎癥促進(jìn)脂肪在白色脂肪組織內(nèi)的分解及在其

7、他組織的沉積，代謝性炎癥引起脂肪重分布這一重要機(jī)制參與多種代謝性相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展，其中涉及的分子信號(hào)通路仍不明了。在炎癥狀態(tài)下，某種膜蛋白是否在機(jī)體表達(dá)，能夠跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)脂肪組織中的脂質(zhì)至其他組織，使組織的脂質(zhì)重分布。
　　第二部分：炎癥對(duì)不同組織FAT/CD36表達(dá)的影響
　　目的：炎癥介導(dǎo)各種組織脂質(zhì)代謝紊亂的分子信號(hào)通路眾多，有研究者在炎癥模型小鼠中同樣觀察到脂質(zhì)在組織間的異位沉積，認(rèn)為炎癥刺激非脂肪組織的生脂基因固醇調(diào)

8、節(jié)元件結(jié)合蛋白1及其下游靶點(diǎn)表達(dá)增加，而脂肪組織生脂關(guān)鍵基因的表達(dá)減少，脂肪相關(guān)分解酶表達(dá)增加。此觀點(diǎn)不能很好闡述整個(gè)機(jī)體對(duì)炎癥刺激的反應(yīng)特點(diǎn)，也不能解釋各個(gè)組織器官間相互作用的機(jī)理。
　　脂質(zhì)代謝紊亂過(guò)程早期有血液游離脂肪酸的增加，研究游離脂肪酸相關(guān)的代謝酶尤為重要，脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)酶(FAT)/CD36作為脂肪酸重要代謝酶之一，在各種組織細(xì)胞有廣泛的分布，檢測(cè)FAT/CD36表達(dá)能更好觀察機(jī)體對(duì)炎癥反應(yīng)的分子調(diào)節(jié)過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)炎癥

9、模型，檢測(cè)小鼠肌肉、脂肪和腎臟組織的FAT/CD36表達(dá)。
　　方法：將小鼠骨骼肌、脂肪、腎臟組織的石蠟切片取出，按照免疫組化染色方法觀察各個(gè)組的FAT/CD36蛋白的表達(dá)情況。稱取0.1g肌肉、脂肪和腎臟組織提取蛋白成分，BCA法測(cè)定組織全蛋白濃度，再按照Western Blot方法定量檢測(cè)各組小鼠骨骼肌、脂肪、腎臟組織中FAT/CD36蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：通過(guò)免疫組化染色和免疫印跡，與HCD組比較，HCD+Casei

10、n組小鼠的FAT/CD36蛋白的表達(dá)顯著增加。
　　結(jié)論：大量研究表明，在病理狀態(tài)下，過(guò)多的FFA可以從脂肪組織溢出轉(zhuǎn)向非脂肪組織，并轉(zhuǎn)化為TG儲(chǔ)存在這些非脂肪組織中。有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白的表達(dá)增加可能與脂肪異位沉積密切相關(guān)。而本研究通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，觀察到炎癥狀態(tài)下的小鼠骨骼肌、脂肪、腎臟等組織的FAT/CD36表達(dá)增加，F(xiàn)AT/CD36作為一種重要的脂肪酸跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，能促進(jìn)肌肉、脂肪和腎臟等組織的脂肪酸的攝取同時(shí)，又能

11、促進(jìn)各種組織的炎癥調(diào)節(jié)。脂肪組織作為脂質(zhì)的儲(chǔ)存器官，能夠與其他組織共同產(chǎn)生分泌炎癥因子，而炎癥因子促進(jìn)FAT/CD36的表達(dá)，促使脂肪酸在組織間的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，引起脂質(zhì)的重分布。
　　第三部分：炎癥對(duì)脂肪酸負(fù)荷的腎細(xì)胞FAT/CD36表達(dá)的影響
　　目的：游離脂肪酸FFA在腎細(xì)胞的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)對(duì)慢性腎臟疾病(CKD)的發(fā)生發(fā)展起了重要作用。FAT/CD36是一種脂肪酸跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，對(duì)細(xì)胞脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)起重要作用。然而，在脂質(zhì)代謝紊亂和慢

12、性炎癥等病理狀態(tài)下，由FFA跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)介導(dǎo)的腎臟損害分子機(jī)制仍不清楚。本研究通過(guò)細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)觀察炎癥對(duì)脂肪酸負(fù)荷的腎細(xì)胞FAT/CD36表達(dá)的影響。
　　方法：分別給予0mmol/L、0.02mmol/L、0.04mmol/L、0.08mmol/L、0.16mmol/L、0.32mmol/L軟脂酸刺激人腎系膜細(xì)胞HMCs和人腎小管上皮細(xì)胞HK-224小時(shí)。提取腎細(xì)胞的總RNA和蛋白，分別采用RealTime PCR和Western

13、blotting方法檢測(cè)FAT/CD36的mRNA和蛋白的表達(dá)。選取0.04.mmol/L軟脂酸聯(lián)合25ng/ml TNF-α或20 ng/ml IL-6處理腎細(xì)胞24小時(shí)后進(jìn)一步通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR和Western blotting方法觀察炎癥對(duì)腎細(xì)胞：FAT/CD36mRNA及蛋白表達(dá)的影響；通過(guò)油紅0染色來(lái)檢測(cè)兩種腎細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)聚集情況；定量比色法檢測(cè)兩種細(xì)胞甘油三酯TG水平；用酶聯(lián)免疫吸附法來(lái)檢測(cè)細(xì)胞游離脂肪酸FFA含量。
　

14、　結(jié)果：(1)軟脂酸呈濃度依賴性上調(diào)HMCs和HK-2 FAT/CD36mRNA和蛋白表達(dá)。(2)炎癥明顯刺激脂肪酸負(fù)荷的腎細(xì)胞FAT/CD36mRNA和蛋白表達(dá)增加。(3)油紅O染色及胞內(nèi)TG和FFA含量測(cè)定進(jìn)一步顯示炎癥加重腎細(xì)胞的脂質(zhì)積聚。
　　結(jié)論：慢性腎功能衰竭的病人體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂的發(fā)病機(jī)制仍未完全認(rèn)識(shí)，目前普遍認(rèn)為高脂血癥可能引起腎功能惡化，有研究證實(shí)脂代謝紊亂可以通過(guò)腎小球細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等作用，引起慢性腎