共軛亞油酸對HepG2細(xì)胞脂質(zhì)代謝的影響及其機制研究.pdf

1、共軛亞油酸（conjugatedlinoleicacid，CLA）是一組天然存在的具有18個碳原子，含有共軛雙鍵的多不飽和脂肪酸，是亞油酸（linoleicacid，LA）的位置和幾何異構(gòu)體。許多研究發(fā)現(xiàn)，CLA有抗腫瘤、防止動脈粥樣硬化、抗糖尿病、提高機體免疫力、增加骨密度、減少體脂等多種生理功能。其中CLA減少體脂的作用受到研究者的廣泛關(guān)注。但是一些研究發(fā)現(xiàn)，CLA在減少體內(nèi)脂肪的同時，肝臟中出現(xiàn)脂質(zhì)沉積的現(xiàn)象，導(dǎo)致肝臟腫大；也有研

2、究發(fā)現(xiàn)肝臟脂肪分解代謝增加，肝臟脂肪減少，其確切的分子機制尚不明確。
　　絲氨酸/蘇氨酸激酶-蛋白激酶B（PKB/Akt）是高等真核生物細(xì)胞中關(guān)鍵的信號節(jié)點。在細(xì)胞因子、生長因子的作用下，PKB/Akt作為磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）活化后的下游靶點，在細(xì)胞代謝、細(xì)胞存活、細(xì)胞周期調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用。PI3K-PKB/Akt信號通路是胰島素調(diào)節(jié)代謝作用的重要信號路徑，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞中脂肪代謝及糖代謝過

3、程。因此，我們推測CLA對肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝的作用和PI3K-PKB/Akt信號通路有關(guān)。
　　本實驗以HepG2細(xì)胞為研究對象，通過觀察細(xì)胞脂質(zhì)沉積、乙酰輔酶A羧化酶（ACC）mRNA表達(dá)、Akt、p-Akt、AMPK、p-AMPK蛋白的表達(dá)情況，研究CLA影響肝臟脂質(zhì)代謝的可能機制。通過PI3K抑制劑LY294002干預(yù)細(xì)胞，進(jìn)一步研究PI3K-PKB/Akt信號通路在CLA影響HepG2細(xì)胞脂質(zhì)代謝中的作用。
　　實驗方法

4、
　　體外培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，以不同濃度CLA（10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L）作用細(xì)胞24小時，胰島素溶液（100nmol/L）干預(yù)1小時后，比色法測定培養(yǎng)液中游離脂肪酸的含量；采用油紅O染色方法觀察細(xì)胞中脂質(zhì)沉積情況；RT-PCR方法檢測乙酰輔酶A羧化酶（ACC）mRNA表達(dá)水平；Western-blot方法檢測細(xì)胞中p-Akt、Akt、p-AMPK、AMPK蛋白的表達(dá)情況。通過PI3K的抑制劑LY29

5、4002預(yù)處理抑制Akt蛋白磷酸化水平后，進(jìn)一步觀察CLA對HepG2細(xì)胞脂質(zhì)沉積的影響。
　　實驗結(jié)果
　　1)CLA增加HepG2細(xì)胞中脂質(zhì)沉積：與對照組相比，50μmol/L、100μmol/LCLA組，細(xì)胞中紅染脂滴明顯增多。
　　2)CLA作用HepG2細(xì)胞后培養(yǎng)液中游離脂肪酸降低：與對照組相比，50μmol/L、100μmol/LCLA組的培養(yǎng)液中游離脂肪酸的含量分別降低了25％、50％（P﹤0.05）。<

6、br>　　3)CLA增加HepG2細(xì)胞ACCmRNA的表達(dá)：與對照組相比，ACCmRNA表達(dá)水平隨CLA濃度增加而逐漸增高。相對于胰島素對照組，50μmol/LCLA組和100μmol/LCLA組ACC的mRNA表達(dá)水平增高明顯，分別增加了1.38倍、1.53倍。
　　4)CLA增加Akt磷酸化水平：與胰島素對照組相比，50μmol/LCLA組和100μmol/LCLA組，Akt的磷酸化水平明顯增高，其中50μmol/LCLA組A

7、kt磷酸化水平增加了1.98倍，100μmol/LCLA組Akt磷酸化水平增加了2.31倍（n=3，P﹤0.05）。
　　5)CLA降低AMPK蛋白磷酸化水平：隨著CLA作用濃度的升高，AMPK的磷酸化水平逐漸下降。相對于胰島素對照組，50μmol/LCLA組和100μmol/LCLA組，AMPK的磷酸化水平下降顯著（n=3，P﹤0.05），10μmol/LCLA組沒有顯著差異。
　　6)CLA干預(yù)時，用LY294002預(yù)處

8、理抑制Akt磷酸化后，細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積量減少，油紅O染色脂滴明顯減少；細(xì)胞外游離脂肪酸增多，ACC的mRNA表達(dá)水平降低。
　　實驗結(jié)論
　　從本實驗得知，CLA增加了HepG2細(xì)胞的脂質(zhì)沉積。在對其分子機理的研究中發(fā)現(xiàn)，CLA可以顯著增加Akt蛋白的磷酸化水平，改變細(xì)胞中ACC的mRNA表達(dá)，抑制AMPK蛋白的磷酸化水平，提示與CLA對肝臟脂質(zhì)沉積的影響有關(guān)；通過PI3K抑制劑LY294002抑制Akt蛋白的磷酸化水平之后，