重組GRA5蛋白用于弓形蟲(chóng)病免疫診斷的研究.pdf

1、目的：
　　原核表達(dá)和鑒定剛地弓形蟲(chóng)致密顆粒蛋白5（GRA5），以期獲得大量與天然抗原活性相似的弓形蟲(chóng)重組 GRA5蛋白抗原，將獲得的重組蛋白進(jìn)行純化，應(yīng)用純化的GRA5重組蛋白抗原包被在96孔板上，建立ELISA法檢測(cè)弓形蟲(chóng)感染。
　　方法：
　　從GenBank中查到弓形蟲(chóng)GRA5基因序列，根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)合成一對(duì)引物，用RT-PCR方法將GRA5基因擴(kuò)增，構(gòu)建pET28a-GRA5原核表達(dá)載體，雙核酸內(nèi)酶切及序列

2、測(cè)定進(jìn)行鑒定， IPTG誘導(dǎo) pET28a-GRA5轉(zhuǎn)化的 BL21/DE3菌， SDS-PAGE和Western-blotting分析表達(dá)產(chǎn)物并鑒定弓形蟲(chóng)GRA5是否表達(dá)。建立以純化的重組蛋白的間接ELISA法，檢測(cè)收集樣本血清中弓形蟲(chóng)特異性抗體。
　　結(jié)果：
　　成功構(gòu)建剛地弓形蟲(chóng)GRA5基因原核表達(dá)質(zhì)粒，PCR反應(yīng)擴(kuò)增出為363 bp大小的GRA5基因，所構(gòu)建的pET28a-GRA5原核表達(dá)載體經(jīng)雙酶切顯示插入片段大小

3、與上相符，DNA測(cè)序結(jié)果表明與GenBank中錄入的GRA5基因經(jīng)Blast比對(duì)序列同源性100％，原核細(xì)胞表達(dá)的該重組蛋白在SDS-PAGE和Western blot中均有顯示（約14 ku）。將重組GRA5蛋白作為抗原包被在96孔板中，建立了檢測(cè)弓形蟲(chóng)感染的ELISA方法，ELISA法經(jīng)過(guò)優(yōu)化后最終確定：最佳抗原包被濃度為10ug/ml、最佳條件為在37℃作用2h后，在4℃包被過(guò)夜、弓形蟲(chóng)血清最佳稀釋度為1:25，最佳封閉條件為用5

4、%脫脂奶粉在37℃作用2h，二抗最佳工作濃度為1:20000，底物的最佳反應(yīng)時(shí)間為20min。本實(shí)驗(yàn)建立的ELISA法檢測(cè)的100例弓形蟲(chóng)感染病人（血清學(xué)陽(yáng)性）血清中有73例呈陽(yáng)性，陽(yáng)性率為73％（73/100），其中40例IgG陽(yáng)性標(biāo)本的陽(yáng)性率為72.5%（29/40），30例IgM陽(yáng)性標(biāo)本的陽(yáng)性率為53.3%（16/30），30例IgG、IgM均陽(yáng)性標(biāo)本的陽(yáng)性率為93.3%（28/30），30例陰性血清標(biāo)本的陽(yáng)性率僅為6.7%（2/