1、剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)是能夠感染所有溫血?jiǎng)游锏臋C(jī)會(huì)性致病寄生蟲,它寄生于機(jī)體的有核細(xì)胞內(nèi)從而引發(fā)弓形蟲?。═oxoplasmosis)。該寄生蟲主要通過污染的食物和水感染宿主,同時(shí)也存在垂直傳播,通過母嬰傳播的方式來感染子代,孕婦若感染弓形蟲可能導(dǎo)致胎兒流產(chǎn)、畸形或者死胎等。據(jù)統(tǒng)計(jì)全球約三分之一的人口感染過弓形蟲,并且其對畜牧業(yè)的影響也非常重大,因此在醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)上均受到廣泛重視,但是目前并沒有有效的藥物能夠根
2、除弓形蟲,因此弓形蟲疫苗的研制一直是近年來研究熱點(diǎn)之一。
自然界中廣泛存在的乳酸菌是構(gòu)成益生菌的重要成員之一,它不僅可以抑制人和動(dòng)物腸道有害菌的生長,還能調(diào)節(jié)菌群的平衡和內(nèi)環(huán)境pH的穩(wěn)定,使機(jī)體保持穩(wěn)定的免疫狀態(tài)。乳酸菌是一類具有佐劑活性的非病原菌,不產(chǎn)生內(nèi)毒素,通過它表達(dá)的外源蛋白可直接隨菌體服下,是目前較為理想的轉(zhuǎn)化和表達(dá)系統(tǒng),且具有廣闊的應(yīng)用前景。
本論文對弓形蟲致密顆粒蛋白4、7、20(GRA4、GRA7、G
3、RA20)和棒狀體蛋白20(ROP20)基因序列的變異做了分析。首先對不同宿主和地理來源的蟲株進(jìn)行PCR擴(kuò)增,再進(jìn)行克隆測序,然后用Clustal X1.83進(jìn)行序列比對,最后再用最大相似法(maximum likelihood,ML)、鄰接法(neighbor joining,NJ)和最大簡約法(maximum parsimony,MP)構(gòu)建種系發(fā)育樹。結(jié)果表明:在12株不同蟲株當(dāng)中,GRA4和GRA7的基因序列分別為966bp和71
4、2bp,其種內(nèi)變異率分別為0~2.4%和0~2.7%;在16株蟲株中,GRA20基因序列為1586bp,種內(nèi)變異率為0~7.9%,當(dāng)去掉Ⅲ型蟲株(CTG、VEG)后,種內(nèi)變異率為0~0.7%;在18株不同的弓形蟲蟲株當(dāng)中,ROP20基因序列為1659bp,種內(nèi)變異率為0~1.4%。通過構(gòu)建種系發(fā)育樹顯示,GRA4基因不能較好的反應(yīng)不同蟲株間的遺傳變異關(guān)系,GRA7基因能區(qū)分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型蟲株,GRA20基因能區(qū)分Ⅰ型和Ⅲ型蟲株,ROP20
5、基因能區(qū)分弓形蟲Ⅰ型和ToxoDB#9型蟲株。
本論文還以乳酸桿菌作為載體來探討弓形蟲GRA4和GRA7在口服免疫方式下的免疫效果。首先根據(jù)ToxoDB網(wǎng)站上收錄GT1型蟲株的GRA4和GRA7基因序列用Primers5.0設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)NcoⅠ和XbaⅠ的引物,并在兩個(gè)蛋白的C端引入His標(biāo)簽。經(jīng)過PCR擴(kuò)增和克隆測序,得到的GRA4和GRA7序列,并將其分別連接轉(zhuǎn)化至大腸桿菌-乳酸菌穿梭表達(dá)載體pSIP-409中,由此成
6、功構(gòu)建重組表達(dá)載體pSIP-409-GRA4和pSIP-409-GRA7。將重組質(zhì)粒pSIP-409-GRA4和pSIP-409-GRA7通過電轉(zhuǎn)化技術(shù)轉(zhuǎn)入Lb.plantarum NC8中,并進(jìn)行雙酶切及PCR鑒定,再用Western-blot分析,成功制備弓形蟲GRA4和GRA7重組乳酸菌后,再將其免疫小鼠。首先將小鼠分為空白組、空白奶粉組和Nc8-pSIP-409乳酸桿菌空載體組三個(gè)對照組以及Nc8-409-GRA4和Nc8-40
7、9-GRA7重組乳酸桿菌組兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組,以口服的方式來免疫小鼠。免疫程序?yàn)槊恐苓B續(xù)口服三天,每次每只小鼠灌服1.0×109cfu/200μL,連免兩周后間隔一周,再加強(qiáng)免疫兩次。待免疫結(jié)束后,測定相應(yīng)的體液免疫和細(xì)胞免疫指標(biāo),并在一免后42d,用強(qiáng)毒株RH速殖子(103個(gè)/只)通過腹腔接種感染小鼠,記錄每組小鼠存活時(shí)間。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:弓形蟲GRA7重組乳酸菌疫苗在對小鼠口服免疫后其機(jī)體內(nèi)可產(chǎn)生較高水平的IgG和IgG2a以及IFN-γ,并
8、產(chǎn)生高水平的CD3+CD4-CD8+和CD3+CD4+CD8-T細(xì)胞,能夠有效地產(chǎn)生Th1型免疫應(yīng)答,而GRA4重組乳酸菌疫苗的免疫原性較弱。在對小鼠腹腔注射弓形蟲RH速殖子后,對照組小鼠的平均存活時(shí)間為6.1d,NC8-409-GRA7組小鼠的平均存活時(shí)間延長至6.8d,但與對照組相比無顯著差異,而NC8-409-GRA4組小鼠的平均存活時(shí)間與對照組相比未延長。
本實(shí)驗(yàn)首次將弓形蟲GRA4、GRA7與乳酸菌重組進(jìn)行口服免疫,