剛地弓形蟲肌動(dòng)蛋白基因的克隆、表達(dá)及重組蛋白的保護(hù)性免疫.pdf

1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?br>　　 對(duì)剛地弓形蟲肌動(dòng)蛋白（TgACT）基因進(jìn)行克隆、表達(dá)、純化，分析其抗原性，觀察不同劑量rTgACT免疫小鼠誘導(dǎo)的黏膜及系統(tǒng)免疫應(yīng)答及最佳劑量免疫小鼠的抗弓形蟲感染的能力，探討TgACT作為弓形蟲疫苗候選抗原的可能性。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 第一部分：構(gòu)建重組質(zhì)粒pET30a-TgACT，并在大腸桿菌中高效表達(dá)。收集、純化RH株弓形蟲速殖子，提取總RNA;設(shè)計(jì)合成引物并引入EcoRⅠ和XhoⅠ酶

2、切位點(diǎn)，RT-PCR擴(kuò)增編碼TgActin的基因片段克隆到原核質(zhì)粒pET30a中，經(jīng)雙酶切、PCR及測(cè)序鑒定陽(yáng)性克??；在大腸桿菌BL21/DE3中用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE進(jìn)行鑒定，通過(guò)稀釋復(fù)性的方法獲得大量表達(dá)蛋白，以Ni-NTA層析法純化蛋白，用兔抗弓形蟲血清做Westenblotting分析其抗原性。
　　 第二部分：觀察不同劑量rTgACT滴鼻免疫小鼠誘導(dǎo)的黏膜和系統(tǒng)免疫應(yīng)答。BALB/c小鼠50只隨

3、機(jī)分為5組，免疫組分別用10μg、20μg、30μg、40μgrTgACT/只滴鼻免疫小鼠3次，首免與二免間隔2周，二免后1周三免，rTgACT溶于20μlPBS中，對(duì)照組用等量PBS滴鼻。三免后第14d，眼靜脈叢采血，分離血清。頸椎脫臼處死小鼠，采集小腸沖洗液、鼻咽和陰道沖洗液。ELISA法測(cè)定上述3種沖洗液IgA和血清IgG。分離脾淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)并培養(yǎng)，ELISA法測(cè)定脾細(xì)胞培養(yǎng)液上清中IL-2和IL-4(24h)及IFN-γ(96h

4、)水平。用rTgACT和ConA刺激脾淋巴細(xì)胞，CCK-8試劑盒測(cè)定其增殖程度。確定rTgACT的最佳免疫劑量。
　　 第三部分：觀察30μgrTgACT滴鼻免疫小鼠誘導(dǎo)的抗弓形蟲感染保護(hù)作用。BALB/c小鼠40只隨機(jī)分為2組，用30μgrTgACT溶于20μlPBS中滴鼻免疫小鼠3次，首免與二免間隔2周，二免后1周三免，，對(duì)照組用等量PBS滴鼻。末次免疫后第14d，用8x104個(gè)速殖子/只灌胃攻擊全部小鼠，觀察小鼠健康狀況。

5、攻擊后第30d，頸椎脫臼處死小鼠，分離計(jì)數(shù)肝、腦組織內(nèi)弓形蟲速殖子。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 第一部分：從弓形蟲RH株cDNA中擴(kuò)增出1131bp的TgACT基因片段，并成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pET30a-TgACT;SDS-PAGE結(jié)果表明，目的基因在大腸桿菌BL21/DE3中以包涵體形式高效表達(dá)，相對(duì)分子量(Mr)約49kDa，比預(yù)期值大約7kDa。通過(guò)稀釋復(fù)性的方法獲得大量表達(dá)蛋白，經(jīng)Ni-NTA純化后的蛋白濃度較低。用

6、超濾濃縮管濃縮蛋白以提高蛋白濃度。Westernblotting顯示純化后的rTgACT能被兔抗弓形蟲免疫血清識(shí)別。
　　 第二部分：不同劑量rTgACT滴鼻免疫小鼠，與對(duì)照組相比，均不同程度誘導(dǎo)了小鼠特異性免疫應(yīng)答。血清弓形蟲特異性IgG,30μg、40μg組與對(duì)照組差異顯著，鼻咽、陰道沖洗液特異性IgA30μg組高與對(duì)照組（P＜0.05）。小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果各組之間也無(wú)顯著性差異。IL-2各組之間變化無(wú)顯著差異；IL

7、-4，與對(duì)照組相比，10μg、20μg、30μg、40μg組均增高(P＜0.05)，各免疫組之間無(wú)顯著差異；IFN-γ，與對(duì)照組相比，10μg、20μg、30μg、40μg組均增高(P＜0.05)，各免疫之間無(wú)顯著差異。總之，20μg、30μg、40μg都可以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答反應(yīng),30μg組可以更有效地誘導(dǎo)粘膜和系統(tǒng)免疫應(yīng)答。綜合分析，確定30μg為較理想免疫劑量。
　　 第三部分：30μgrTgACT與PBS滴鼻免疫小鼠，末次免疫

8、2周后，用8×104個(gè)速殖子/只灌胃攻擊全部小鼠攻擊后第2～20d，小鼠出現(xiàn)豎毛、倦怠、活動(dòng)減少、飲水及采食減少等異常表現(xiàn)。對(duì)照組小鼠死亡10只，免疫組死亡10只。免疫組肝組織內(nèi)蟲荷（速殖子數(shù)）77.89±20.00×105/g顯著低于對(duì)照組肝組織內(nèi)蟲荷（速殖子數(shù)）169.77±59.74×105/g(P＜0.05)，減蟲率為54.12％;腦組織內(nèi)蟲荷（速殖子數(shù)）13.20±2.54×105/g顯著低于對(duì)照組22.29±3.35×105