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文檔簡(jiǎn)介
1、2002年，Richardson等人從一類嗜熱球菌屬(Thermococcus sp.)的古細(xì)菌中克隆并重組得到了一個(gè)α-淀粉酶基因BD5088。在熒光假單胞菌Pseudomonasfluorescens獲得表達(dá)。這個(gè)人工重組酶的最適pH為4.5，最適溫度為95℃，是一種耐熱耐酸α-淀粉酶，具有潛在的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。
BD5088基因全長(zhǎng)1308bp，編碼的蛋白質(zhì)含436個(gè)氨基酸。該基因已由本實(shí)驗(yàn)室合成，且克隆到大腸桿菌的表
2、達(dá)載體pET30a上，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pET30a-BD5088。在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)，表達(dá)出的目的蛋自分子量約為48 ku，大小與理論值一致。重組α-淀粉酶BD5088具有α-淀粉酶的活性，最適反應(yīng)溫度80℃，最適反應(yīng)pH值為6.0，在100℃下酶活性半衰期約30min?；钚圆灰蕾囉贑a2+。
本實(shí)驗(yàn)首先以pET30a-BD5088為模板，設(shè)計(jì)含隨機(jī)核苷酸序列的互補(bǔ)引物，對(duì)α-淀粉酶基因BD5088的R32，
3、A99，N125，D126，G155，Q181，E182，A241，以及E151，A154位氨基酸進(jìn)行多位點(diǎn)定點(diǎn)突變，獲得各多位點(diǎn)隨機(jī)突變體庫(kù)。然后將該突變體庫(kù)轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21進(jìn)行表達(dá)。篩選突變體測(cè)定其α-淀粉酶活性。
經(jīng)過初步篩選，選擇了8個(gè)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行DNA測(cè)序，全部發(fā)生了多位點(diǎn)突變。對(duì)突變子進(jìn)行了α-淀粉酶活性檢測(cè)，有5個(gè)突變體的酶活高于α-淀粉酶基因BD5088。其中除了Mut5的最適溫度提高到了85℃，各突變
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