空腸彎曲菌新基因cj0371突變株特性分析及其在趨化通路中的作用研究.pdf

1、空腸彎曲菌（Campylobacter jejuni）是革蘭氏陰性菌，微需氧菌，是世界范圍內(nèi)引起人類胃腸炎的主要食源性病原菌之一。目前對于空腸彎曲菌為什么能夠定殖在家禽腸道中與之共生及為什么會導(dǎo)致人類患病仍然知之甚少。目前雖可以輕而易舉獲得不同空腸彎曲菌的基因組信息，但是若要全面了解空腸彎曲菌的致病機(jī)制還需要更多的研究。相比其他腹瀉性致病菌，空腸彎曲菌沒有很多典型的毒力因子，但是一些非典型的毒力因子卻比比皆是。
　　本實驗室曾使用

2、體內(nèi)誘導(dǎo)抗原技術(shù)(IVIT)篩選空腸彎曲菌感染人或雞時所表達(dá)的毒力相關(guān)基因，cj0371就是通過此方法篩選到的一個特異性基因。本文在實驗室前人構(gòu)建了cj0371突變株的基礎(chǔ)上，就該突變株做了多種生物學(xué)特性分析及毒力評估，初步評價了Cj0371蛋白的免疫學(xué)特性;同時對該基因可能的作用通路—趨化通路做了深入探究，為空腸彎曲菌致病機(jī)制的研究增添了新信息。
　　一、空腸彎曲菌cj0371突變株生物學(xué)特性分析
　　本文首先對cj037

3、1基因的功能位點進(jìn)行細(xì)胞亞定位，使用激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)融合蛋白Cj0371-GFP在空腸彎曲菌的兩極發(fā)光;另外細(xì)胞質(zhì)膜蛋白亞定位發(fā)現(xiàn)Cj0371在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜中都有存在，因此推測Cj0371可能是一個跨膜蛋白;半固體平板運(yùn)動力分析實驗顯示，cj0371突變株的運(yùn)動力大于野生株的運(yùn)動力，回復(fù)株運(yùn)動力較野生株和突變株都弱;使用透射電鏡觀察突變株和野生株的鞭毛沒有發(fā)現(xiàn)差異。本研究還測試了突變株與野生株的生長曲線，結(jié)果顯示突變株的生長速

4、度大于野生株，且從培養(yǎng)6h開始，突變株和野生株的生長速度有顯著性差異。使用硬瓊脂法進(jìn)行趨化性分析結(jié)果顯示以DL-蘋果酸、α-酮戊二酸和丁二酸作為誘導(dǎo)性趨化物時突變株的趨化能力均大于野生株。
　　突變株毒力分析實驗包括體外黏附侵襲實驗、體內(nèi)定殖實驗及感染細(xì)胞炎性因子定量分析實驗等。體外黏附侵襲實驗結(jié)果表明，突變株的黏附侵襲力大于野生株，尤其是侵襲力與野生株之間具有極顯著差異(P＜0.01）。仔兔定殖實驗結(jié)果顯示突變株的定殖力大于野生

5、株，且在定殖48h時，具有顯著性差異(P＜0.05）。突變株和野生株刺激細(xì)胞后炎性因子定量分析實驗選擇的細(xì)胞模型是禽類巨噬細(xì)胞HD11和小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，測定的炎性因子有IL-6，IL-1β及趨化因子等;無論是HD11還是小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，經(jīng)空腸彎曲菌刺激后炎性因子表達(dá)都顯著上調(diào)，但是突變株和野生株之間并沒有顯著性差異。將Cj0371蛋白表達(dá)純化后同樣刺激以上兩個細(xì)胞模型，刺激HD11細(xì)胞后趨化因子和iNOS基因顯著上調(diào)，但是IL-6，

6、IL-1β等表達(dá)量變化沒有差異，而小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的IL-6，IL-1β等都有顯著上調(diào)表達(dá)。
　　二、cj0371基因在空腸彎曲菌趨化通路中的作用研究
　　為深入研究cj0371基因的功能，本研究設(shè)計了免疫共沉淀偶聯(lián)質(zhì)譜分析實驗，篩選與Cj0371蛋白相互作用的已知蛋白，根據(jù)已知蛋白的信息來推測Cj0371蛋白的功能。質(zhì)譜分析實驗共得到40多個疑似蛋白，主要集中在趨化通路、代謝通路。本研究選擇趨化通路繼續(xù)深入研究。首先通過q

7、RT-PCR方法定量檢測突變株和野生株中趨化通路基因及受趨化通路影響的鞭毛基因的表達(dá)量，實驗結(jié)果顯示，突變株中cheV、cj1110c、cj1564和cj0262c等趨化通路基因無論是在細(xì)菌生長早期還是晚期都上調(diào)表達(dá);鞭毛基因在細(xì)菌生長早期鞭毛基部基因上調(diào)表達(dá)。尤其是其表達(dá)量始終顯著大于野生株(12h，P＜0.05;24h，P＜0.01)。其次，將趨化通路基因cheV、 cheA、cheY、 cj1110c、cj1564、cj0262c

8、進(jìn)行原核表達(dá)，并使用體外GST pull-down技術(shù)分別驗證與Cj0371蛋白的相互作用，結(jié)果表明只有CheV蛋白與Cj0371蛋白有相互作用關(guān)系。另外本研究將CheV、CheA、CheY、Cj0371、Cj6462等蛋白純化后體外模擬空腸彎曲菌趨化通路并使用酶連分光光度分析法檢測了在通路中有Cj0371存在與不存在于趨化反應(yīng)液中時CheA蛋白ATPase活性變化，結(jié)果顯示在不含有Cj0371蛋白的趨化反應(yīng)液中，系統(tǒng)消耗ATP速率更快

9、;同時檢測了在添加和未添加CheV蛋白于趨化反應(yīng)系統(tǒng)中時CheA蛋白ATPase活性的變化，實驗結(jié)果只能說明CheV在趨化通路中具有重要作用，但不能說明CheV和Cj0371蛋白間的關(guān)系。最后本研究還解析Cj0371與CheV相互作用的結(jié)構(gòu)域，原核表達(dá)了CheV的CheW-like結(jié)構(gòu)域和反應(yīng)調(diào)控結(jié)構(gòu)域，并用GST pull-down技術(shù)驗證CheV蛋白的哪個結(jié)構(gòu)域與Cj0371蛋白相互作用;實驗表明Cj0371蛋白與CheV的反應(yīng)調(diào)控