基因轉(zhuǎn)錄激活子MeCP2和Rb調(diào)控環(huán)沉默在氫醌誘發(fā)細(xì)胞惡變過程中的作用及表觀遺傳學(xué)機(jī)制.pdf

1、研究背景:
　　DNA甲基化、組蛋白修飾等表觀遺傳學(xué)修飾(epigenetic modification)在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)過程起著重要作用，是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中重要的分子事件，是近年來生命科學(xué)的熱門研究領(lǐng)域之一，其中DNA甲基化是研究得最為廣泛的表觀遺傳學(xué)修飾。
　　MeCP2(methyl-CpG binding protein2)是MBD家族最重要的成員之一，也是潛在的腫瘤臨床治療靶點(diǎn)。大量研究表明，MeCP2是一個(gè)多功能

2、基因，而這些功能絕大多數(shù)是通過對(duì)其他基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)而實(shí)現(xiàn)的。
　　苯是一種常見的環(huán)境污染物和重要的工業(yè)溶劑，是一種全球用量極大的環(huán)境致癌物，其過量暴露和急性髓細(xì)胞白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)升高有關(guān)。氫醌（hydroquinone，HQ）是苯的重要代謝產(chǎn)物，是一種具有血液毒性的毒物，長(zhǎng)期、過量暴露于HQ能引起貧血、白血病等血液疾病，由于不需活化即有生物學(xué)活性，是苯的常用體外研究替代物。Me

3、CP2表達(dá)異常在各種腫瘤組織和細(xì)胞中非常常見，且普遍為高表達(dá)。國內(nèi)外而關(guān)于毒物對(duì)MeCP2表達(dá)的影響研究非常少。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，MeCP2表達(dá)在HQ處理細(xì)胞、HQ誘導(dǎo)惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞中呈現(xiàn)出動(dòng)態(tài)變化，且Rb表達(dá)與MeCP2的表達(dá)在不同時(shí)間點(diǎn)的相關(guān)關(guān)系一直保持不變，提示Rb很有可能受MeCP2的正性調(diào)節(jié)。
　　Rb基因(retinoblastoma gene)是腫瘤臨床治療靶點(diǎn)，Rb的功能涉及細(xì)胞凋亡和衰老、細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、應(yīng)對(duì)D

4、NA損傷和維持基因組穩(wěn)定，同時(shí)研究表明，Rb表達(dá)異常在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程也起非常重要的作用，但其異常表達(dá)的機(jī)制尚不清晰。
　　綜上，前期研究結(jié)果、生物信息學(xué)分析結(jié)果和前人關(guān)于Rb和MeCP2功能研究結(jié)果，我們提出假設(shè):HQ誘發(fā)的癌變過程中，MeCP2與Rb之間很可能存在正調(diào)控環(huán)，該調(diào)控環(huán)使MeCP2和Rb在HQ誘導(dǎo)的癌變進(jìn)程中，表達(dá)量越來越低以致其沉默，其中表觀遺傳學(xué)改變?cè)诖诉^程發(fā)揮重要作用。為證實(shí)該假設(shè)開展了本研究。
　　

5、研究方法:
　　1.細(xì)胞及HQ劑量選擇
　　使用TK6淋巴母細(xì)胞進(jìn)行本研究，遵循兩個(gè)原則:(1)細(xì)胞染毒后能觀察到HQ對(duì)細(xì)胞有一定的毒性，但細(xì)胞活力不能小于75％;(2)我國涉苯行業(yè)苯的實(shí)際接觸水平。
　　2.細(xì)胞生物學(xué)性狀檢測(cè)
　　以細(xì)胞計(jì)數(shù)法和CCK-8試劑盒檢測(cè)惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長(zhǎng)速度。細(xì)胞固定后，以PI標(biāo)記，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布情況。使用PI和FITC的雙標(biāo)記法進(jìn)行細(xì)胞標(biāo)記，流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞的凋亡情

6、況進(jìn)行分析。
　　3.化學(xué)物處理
　　使用DNMT甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(5-AZA)、組蛋白乙?；敢种苿?TSA)或DNA損傷誘導(dǎo)劑DOX處理細(xì)胞，24 h后收集細(xì)胞并進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。
　　4.基因表達(dá)水平檢測(cè)
　　使用TRIzol試劑提取細(xì)胞RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，用SYBR Green定量RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞mRNA表達(dá)水平。使用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞并提取總蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白濃度，Western blotting檢

7、測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)水平。細(xì)胞用甲醇固定后，使用間接免疫熒光流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Rb和MeCP2蛋白表達(dá)。
　　5.甲基化特異性PCR檢測(cè)基因啟動(dòng)子DNA甲基化水平
　　在UCSC數(shù)據(jù)庫調(diào)取基因啟動(dòng)子DNA序列，使用methyl primer express甲基化特異性PCR引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物。使用試劑盒提取細(xì)胞基因組DNA后，使用基因組DNA進(jìn)行CpG修飾。使用PCR方法檢測(cè)啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化水平。
　　6.生物信息學(xué)分析<

8、br>　　從UCSC調(diào)取Rb啟動(dòng)子區(qū)DNA序列，查閱相關(guān)文獻(xiàn)并使用consite等軟件預(yù)測(cè)MeCP2結(jié)合位點(diǎn)。
　　7.染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）檢測(cè)啟動(dòng)子區(qū)蛋白結(jié)合情況
　　設(shè)計(jì)PCR引物，細(xì)胞使用1％甲醛交聯(lián)后，提取細(xì)胞核，超聲和核酶處理細(xì)胞核。使用chip級(jí)別抗體進(jìn)行染色質(zhì)沉淀，對(duì)染色質(zhì)進(jìn)行純化，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)沉淀染色質(zhì)含量進(jìn)行檢查。
　　8.慢病毒MeCP2表達(dá)載體構(gòu)建及穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞構(gòu)建

9、　　使用基因克隆的方法將MeCP2的CDS克隆至Plvx-puro真核表達(dá)載體，使用慢病毒進(jìn)行包裝并感染細(xì)胞，感染后的細(xì)胞使用嘌呤霉素進(jìn)行篩選，獲得穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞后用Western blotting對(duì)MeCP2表達(dá)量進(jìn)行鑒定。
　　9.Co-IP檢測(cè)MeCP2/Rb蛋白復(fù)合體
　　RIPA裂解液裂解細(xì)胞后，調(diào)整蛋白濃度使每個(gè)樣品蛋白濃度一致，按500μg/μg抗體加入抗體，4℃搖床過夜，加入瓊脂糖珠，4℃搖床1h，收集上清，使

10、用細(xì)胞裂解液洗滌3次，加入SDS上樣緩沖液，沸水浴變性5min，進(jìn)行westernblotting檢測(cè)。
　　研究結(jié)果
　　1.染毒劑量的選擇
　　HQ劑量選擇遵循以下兩個(gè)原則:(1)細(xì)胞染毒后能觀察到HQ對(duì)細(xì)胞有一定的毒性，但細(xì)胞活力不能小于75％;(2)我國涉苯行業(yè)苯的實(shí)際接觸水平。因此HQ劑量選擇為0～20.0μmol/L。
　　2.惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞生長(zhǎng)速度檢測(cè)結(jié)果表明，HQ處理細(xì)胞已經(jīng)初步具有腫瘤惡性特征。<

11、br>　　3.惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞周期和凋亡改變
　　惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞S期細(xì)胞比例比正常細(xì)胞增多，由正常細(xì)胞的41.1％上升為48.2％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　4.RB、PTEN、p53、TPOR、H-RAS和miR-223在惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的表達(dá)
　　RT-PCR方法檢測(cè)Rb、PTEN、p53、TPOR和H-RAS五個(gè)基因的mRNA及miR-223的表達(dá)水平，與正常細(xì)胞相比，Rb和PTEN的mRNA表達(dá)量在惡性轉(zhuǎn)

12、化細(xì)胞中的表達(dá)水平下降，分別是正常細(xì)胞的0.61和0.49倍，而TPOR、H-RAS和miR-223的表達(dá)水上升，分別為為正常細(xì)胞的1.91、1.73和2.36倍，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而p53基因mRNA表達(dá)量無明顯改變。western blotting結(jié)果顯示，Rb、PTEN、TPOR和H-RAS基因的表達(dá)水平與RT-PCR的結(jié)果相一致，但是P53蛋白的表達(dá)量比正常細(xì)胞低。
　　5.TSA和5-AZA處理對(duì)惡性轉(zhuǎn)

13、化細(xì)胞Rb和TPOR表達(dá)水平的影響
　　DNMT抑制劑5-AZA和去乙?；福℉DAC）抑制劑TSA處理惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞，5-AZA可使Rb基因的mRNA表達(dá)水平恢復(fù)至正常，對(duì)p53和PTEN基因的mRNA表達(dá)沒有影響，然而可使TPOR的mRNA表達(dá)水平較惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞的上升得更高。
　　6.TSA和5-AZA處理對(duì)惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞生物學(xué)性狀的影響
　　5-AZA和TSA處理均可降低惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞的細(xì)胞活力，其細(xì)胞活力分別是未處理

14、組的49.1％和43.1％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），同時(shí)細(xì)胞周期阻滯于G1期，5-AZA和TSA處理細(xì)胞G1比例分別由對(duì)照組的37.5％上升到60.8％(P＜0.05)和70.3％(P＜0.05)，細(xì)胞凋亡率也顯著提高，分別由對(duì)照組的10.4％上升到23.8％(P＜0.05)和15.1％(P＜0.05)。
　　7.RB、DNMTs、MBDs在HQ處理細(xì)胞和HQ惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的動(dòng)態(tài)表達(dá)
　　只有MeCP2表達(dá)趨勢(shì)和R

15、b的表達(dá)趨勢(shì)保持一致，為正相關(guān)關(guān)系。
　　8.MeCP2調(diào)節(jié)Rb生物信息學(xué)預(yù)測(cè)
　　經(jīng)分析在Rb啟動(dòng)子區(qū)有兩個(gè)CpG島，在CpG島內(nèi)有25個(gè)MeCP2特異性結(jié)合位點(diǎn)，兩個(gè)MBD2結(jié)合位點(diǎn)。
　　9.Rb啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化及MECP2結(jié)合情況檢測(cè)
　　提取用HQ處理5w并脫離處理10天的細(xì)胞DNA進(jìn)行MSP檢測(cè)，結(jié)果表明，Rb啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化程度先隨著HQ劑量的增加而降低，而后又上升。
　　10.TSA

16、和5-AZA處理對(duì)MeCP2和MBD2表達(dá)水平的影響
　　5-AZA和TSA處理能恢復(fù)HQ惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞的MeCP2表達(dá)水平，與HQ惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞相比，表達(dá)水平上升，而MBD2的表達(dá)水平經(jīng)TSA處理后下降，5-AZA處理無顯著性影響。
　　11.Rb蛋白與MeCP2蛋白形成蛋白復(fù)合體
　　CO-IP結(jié)果表明，Rb蛋白和MeCP2蛋白之間能形成蛋白復(fù)合體。
　　12.MeCP2基因恢復(fù)對(duì)惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞Rb基因表達(dá)的恢復(fù)<

17、br>　　與GFP空載體細(xì)胞相比，MeCP2表達(dá)載體細(xì)胞的MeCP2的mRNA表達(dá)水平上升6.25倍，western blotting檢測(cè)結(jié)果得到一致的結(jié)果。Rb的表達(dá)水平和MeCP2的相一致，表明MeCP2能激活Rb表達(dá)。
　　13.Rb調(diào)控MeCP2基因表達(dá)
　　DOX處理可激活惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞Rb蛋白的表達(dá)，同時(shí)伴有MeCP2蛋白表達(dá)的上升。
　　結(jié)論:
　　1.DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、MBD1

18、和MBD2在HQ處理的TK6細(xì)胞及其惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的表達(dá)出現(xiàn)異常，TPOR、H-RAS、PTEN、p53和miR-223在惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的表達(dá)也出現(xiàn)異常。
　　2.Rb和MeCP2表達(dá)在惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的表達(dá)為下調(diào)，在HQ處理的非惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的表達(dá)為上調(diào)，二者的表達(dá)始終保持相同趨勢(shì)。
　　3.MeCP2和Rb之間存在正調(diào)控環(huán)，該調(diào)控環(huán)的沉默在HQ誘發(fā)的腫瘤發(fā)生過程發(fā)揮重要的生物學(xué)作用。
　　4.表觀遺傳學(xué)機(jī)制在HQ介導(dǎo)