基于生物信息學(xué)的胃癌易感性相關(guān)lncRNAs及其功能性SNPs的篩選和功能驗證.pdf

1、胃癌（Gastric Cancer,GC）發(fā)病率和死亡率均居全國癌癥發(fā)病和死亡的第二位，其早期診斷率和中晚期胃癌5年生存率均低于20％，近年胃癌發(fā)病呈現(xiàn)上升和年輕化趨勢。長鏈非編碼 RNAs（Long Noncoding RNA,LncRNAs）是指各種長度大于200個核苷酸且不翻譯成蛋白質(zhì)的RNA分子，在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后以及表觀遺傳等水平調(diào)控基因表達(dá)，廣泛參與機體的生理和病理過程。越來越多研究發(fā)現(xiàn)lncRNAs與胃癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、預(yù)后和耐

2、藥性形成等有關(guān)，有望成為胃癌早期診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物，但lncRNAs發(fā)揮作用的機制尚未闡明。
　　目的：
　　基于生物信息學(xué)，篩選胃癌相關(guān)lncRNAs及其功能性單核苷酸多態(tài)位點（Single Nucleotide Polymorphism,SNP），在大樣本人群中驗證lncRNA遺傳變異與胃癌易感性的關(guān)聯(lián)，并初步探討其生物學(xué)功能。
　　方法：
　　1.生物信息學(xué)篩選：
　　檢索并下載GEO數(shù)據(jù)庫中基于中

3、國人群的胃癌相關(guān)芯片數(shù)據(jù)（GSE50710,GSE53137,GSE58828）。本研究整合多種數(shù)據(jù)庫（Ensembl,refseq, lncRNAdb.v2.0,GENCODE.v24,NONCODE2016,LNcipedia.v3.1,CCDS.v18）并去冗余，采用本地BLASTN算法對高通量芯片進(jìn)行重注釋。
　　然后通過生物信息學(xué)方法篩選出差異表達(dá)的胃癌相關(guān) lncRNAs并預(yù)測其功能，與microRNAs具有潛在結(jié)合位

4、點的lncRNAs及其SNPs進(jìn)入下一步的人群驗證。
　　2.大樣本人群驗證：
　　采用病例對照研究設(shè)計，用PASS8.0.14（http://www.ncss.com/pass.html）計算所需樣本量，按年齡（±3歲）和性別以1：1進(jìn)行個體匹配，收集470例醫(yī)院來源且經(jīng)病理學(xué)確診的胃癌患者及社區(qū)來源的470例正常對照的血液樣本。
　　采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度分析法（PCR-RFLP）對lncRNAs基因及

5、其SNP進(jìn)行基因分型。采用SAS9.1（SAS Institute Inc.,Cary,North Carolina,USA）軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。Hardy-Weinberg在線分析工具對對照人群進(jìn)行 Hardy-Weinberg平衡檢驗。MDR2.0軟件分析基因-環(huán)境交互作用。
　　3.生物學(xué)功能初探：
　　采用熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative reverse transcription-polyme

6、rase chain reaction,qRT-PCR）檢測41例樣本血清中不同基因型lncRNA表達(dá)量。
　　通過熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z驗SNP等位基因變異是否影響相應(yīng)lncRNA與預(yù)測的miRNA的結(jié)合。
　　結(jié)果：
　　1.本研究整合構(gòu)建的蛋白編碼數(shù)據(jù)庫含120,018條記錄，長鏈非編碼RNAs數(shù)據(jù)庫含206,510條記錄。共篩選出189個胃癌相關(guān)差異表達(dá)lncRNAs，最終選擇4個具有潛在的miRNA結(jié)合功能的

7、lncRNAs及其SNP進(jìn)行后續(xù)的人群驗證，分別是lnc-EVX1-3:3（rs1859168）、lnc-MACC1-1:7（rs3815254）、lnc-AMFR-1:1（rs4784659）、lnc-ZNF33B-2:1（rs579501）。
　　2.年齡、性別和飲酒在病例和對照組中的分布無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05），而吸煙和腫瘤家族史在病例組中的比例顯著高于對照組（P<0.05）。多因素非條件logistic回歸分析結(jié)果顯示

8、，調(diào)整年齡、性別、吸煙、飲酒及腫瘤家族史后，在顯性（OR=0.64,95%CI:0.47-0.86）和隱性遺傳模型（OR=1.77,95%CI:1.34-2.35）中均觀察到rs1859168 A等位基因的變異與胃癌的發(fā)病風(fēng)險降低存在統(tǒng)計學(xué)關(guān)聯(lián)；在顯性（OR=0.42,95%CI:0.31-0.57）和加性模型（OR=0.52,95%CI:0.40-0.67）中均發(fā)現(xiàn)rs4784659T能夠降低胃癌的發(fā)病風(fēng)險；同樣，顯性（OR=0.72

9、,95%CI:0.52-0.98）和加性模型（OR=0.73,95%CI:0.56-0.97）也提示攜帶rs579501C等位基因的個體胃癌易感性較低；但在四種模型中均未發(fā)現(xiàn)rs3815254（C>T）與胃癌發(fā)病風(fēng)險之間存在統(tǒng)計學(xué)關(guān)聯(lián)（all P>0.05）。
　　3.基于顯性模型，分別對年齡（﹤50 vs.≥50）、性別（男vs.女）、吸煙（是vs.否）、飲酒（是vs.否）及腫瘤家族史（是vs.否）進(jìn)行分層分析，并調(diào)整其余因素后

10、，發(fā)現(xiàn)rs1859168A, rs579501G等位基因的變異僅在部分層中顯示能夠顯著降低胃癌的發(fā)病風(fēng)險，而rs4784659T等位基因的變異在所有分層亞組中一致顯示與胃癌的發(fā)病風(fēng)險降低有統(tǒng)計學(xué)關(guān)聯(lián)，且這種保護作用在不吸煙人群（OR=0.23,95%CI:0.14,0.38）中相比吸煙人群（OR=0.65,95%CI:0.43,0.98）更明顯（P<0.001）。
　　4.最佳基因-環(huán)境交互作用模型表明具有吸煙史，腫瘤家族史，攜帶

11、rs4784659 CC，rs1859168 CC/AC和rs579501AA人群患胃癌的風(fēng)險是非上述組合人群的5.03倍（OR:5.03;95%CI:3.81-6.65）。
　　5.雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灡砻鞴厕D(zhuǎn)染miR-5002-5p后，攜帶rs579501 A等位基因報告質(zhì)粒的相對熒光素酶活性降低，而共轉(zhuǎn)染miR-5002-5p的抑制劑后，其相對熒光素酶活性升高。
　　6.生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果顯示，rs4784659 G

12、等位基因向A等位基因的變異，為hsa-miR-6852-3p與lnc-AMFR-1:1提供了結(jié)合位點，可能導(dǎo)致lnc-AMFR-1:1表達(dá)水平降低及hsa-miR-6852-3p的靶基因表達(dá)水平升高。
　　7.qRT-PCR結(jié)果顯示，rs4784659 AG（0.52±0.33,n=14）和rs4784659 AA（0.21±0.14,n=9）基因型個體血漿中l(wèi)nc-AMFR-1:1的表達(dá)量（X?S）均低于rs4784659 GG

13、（0.87±0.34,n=18）基因型個體（both P<0.017）。
　　結(jié)論
　　1.rs4784659 T、rs579501 C和rs1859168 A等位基因變異均與胃癌易感性降低有潛在關(guān)聯(lián)。
　　2.rs579501 A等位基因可能通過促進(jìn)hsa-miR-5002-5p與lnc-ZNF33B-2:1的結(jié)合，進(jìn)而抑制lnc-ZNF33B-2:1的表達(dá)，而rs4784659 G等位基因向A等位基因的變異是否影響