牙齒發(fā)育的信號(hào)調(diào)控機(jī)制及淫羊藿苷的干預(yù)研究.pdf

1、研究目的:
　　 1.進(jìn)一步明確將斑馬魚(yú)作為牙齒發(fā)生發(fā)育分子生物學(xué)研究模型的可行性和先進(jìn)性。
　　 2.研究牙齒發(fā)育的重要信號(hào)因子(Pax9基因、Pitx2基因)在斑馬魚(yú)牙齒萌出與替換過(guò)程中的表達(dá)部位和時(shí)間,以探討Pax9基因、Pitx2基因在牙發(fā)生發(fā)育過(guò)程中的作用機(jī)制及作用途徑。
　　 3.研究淫羊藿苷對(duì)牙齒生長(zhǎng)發(fā)育的影響。這將加快實(shí)現(xiàn)牙齒再生目標(biāo),并將為選取中藥進(jìn)行牙齒再生的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提供一定的理論依據(jù)。

2、>　　 研究方法:
　　 1.斑馬魚(yú)的飼養(yǎng)及其受精卵的獲得:將飼養(yǎng)野生型斑馬魚(yú)的水溫控制在28.5℃,設(shè)定其晝夜規(guī)律分別為14小時(shí)和10小時(shí)。將通過(guò)自然交配獲得的受精卵飼養(yǎng)于28.5℃水中。斑馬魚(yú)的發(fā)育階段按下述方法來(lái)劃分:孵化期(0-6天齡);幼蟲(chóng)期(1-4周齡,即7-49天齡);幼體期(1-3月齡,即30一89天齡);成熟期(3月齡以上)。
　　 2.成年斑馬魚(yú)牙齒形態(tài)和組織學(xué)觀察:在體視顯微鏡下,解剖成年斑馬魚(yú)鰓

3、弓,觀察其牙齒,并做石蠟切片和HE染色觀察。取單個(gè)牙齒進(jìn)行組織學(xué)標(biāo)本處理,掃描電鏡下觀察其顯微結(jié)構(gòu)。
　　 3.針對(duì)Pax9基因原位雜交探針的制備:根據(jù)斑馬魚(yú)Pax9基因mRNA序列(GenBank:NM_131298)設(shè)計(jì)和合成針對(duì)Pax9的引物(F:5'-gcaagcttatggaaatctgcagaggcct;R:5'-getggatcccgctcgtcctcctggaagtagaa)。抽提斑馬魚(yú)基因組總RNA,反轉(zhuǎn)錄成c

4、DNA,并以此為模板,擴(kuò)增Pax9基因序列。1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。將純化的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pGEMT。(Promage,Cat.＃A3600)載體中,然后轉(zhuǎn)化到DH5a感受態(tài)菌株中克隆擴(kuò)增質(zhì)粒。將大量擴(kuò)增抽提得到的連接載體質(zhì)粒經(jīng)內(nèi)切酶消化,在含有地高辛標(biāo)記的UTP的體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)中,以T7聚合酶催化合成地高辛標(biāo)記的RNA探針,用于整胚原位雜交。
　　 4.Pax9基因在受精72h以內(nèi)斑馬魚(yú)胚胎中的分布和表達(dá):參考We

5、sterfieldM.TheZebrafishBook.Eugene:UniversityofOregonPress,1995.中的整胚原位雜交和胚胎切片方法,取不同發(fā)育階段的胚胎(以4h為觀察間隔),用4％多聚甲醛溶液固定過(guò)夜(至少固定12h),保存于甲醇溶液中,置-20℃?zhèn)溆?。?×PBST溶液洗去多余的甲醇溶液,將胚胎置于65℃水浴箱進(jìn)行預(yù)雜交3h,然后加入所合成的反義RNA探針,65℃水浴雜交過(guò)夜。用0.2×SSC溶液洗去多余的

6、探針,加入anti-Dig-AP與反義RNA探針結(jié)合過(guò)夜。將未結(jié)合的抗體用1×PBST溶液洗去,再加入(BCIP/NBT/NTMT)顯色30min,迅速用1×PBST溶液洗去多余的顯色液,將此胚胎直接在顯微鏡下觀察并記錄結(jié)果。
　　 5.通過(guò)制備針對(duì)Pitx2基因的探針(同研究方法3),利用整胚原位雜交技術(shù)(同研究方法4)觀察Pitx2基因在斑馬魚(yú)牙齒早期發(fā)育中的表達(dá)情況。
　　 6.研究淫羊藿苷對(duì)牙齒生長(zhǎng)發(fā)育的影響:在

7、飼養(yǎng)野生型斑馬魚(yú)的水中加入淫羊藿苷,觀察45天后斑馬魚(yú)牙齒生長(zhǎng)發(fā)育的變化。在掃描電鏡下觀察其牙齒的顯微結(jié)構(gòu),并對(duì)Ca、P等微量元素做能譜分析。
　　 7.研究淫羊藿苷對(duì)人牙齦成纖維細(xì)胞的中藥干預(yù)作用:對(duì)體外培養(yǎng)的人牙齦成纖維細(xì)胞(humangingivalfibroblasts,HGF),用MTT法檢測(cè)不同濃度的淫羊藿苷(0.001、0.01、0.1μg/mL)、不同時(shí)間(24、48、72、96h)作用下HGF的增殖水平。

8、>　　 研究結(jié)果:
　　 1、掃描電鏡下,斑馬魚(yú)牙齒硬組織也具有類似人類牙釉質(zhì)和牙本質(zhì)樣的結(jié)構(gòu)。人類牙齒的釉質(zhì)表面有平行排列的與牙長(zhǎng)軸垂直的淺凹線紋和不規(guī)則的圓形小凹。斑馬魚(yú)牙齒表面未見(jiàn)淺凹線紋,但是有一些與牙長(zhǎng)軸垂直的顏色較深的條帶,在外形變化大的牙尖處尤為明顯,這可能同人類牙釉質(zhì)表面的線紋一樣和釉質(zhì)沉積有關(guān)。人類牙齒的牙本質(zhì)具有牙本質(zhì)小管,為多孔性組織結(jié)構(gòu),牙本質(zhì)構(gòu)成髓腔,髓腔內(nèi)充滿牙髓等軟組織。斑馬魚(yú)的釉質(zhì)內(nèi)側(cè)組織也呈多

9、孔性疏松組織結(jié)構(gòu),具有很多貫穿其內(nèi)的孔隙,與人類牙齒的牙本質(zhì)結(jié)構(gòu)相似。斑馬魚(yú)牙齒的牙本質(zhì)也圍成一髓腔,其內(nèi)也可見(jiàn)軟組織。HE染色進(jìn)一步觀察到紅染的牙本質(zhì)內(nèi)部為一髓腔,髓腔內(nèi)具有豐富的牙髓細(xì)胞。
　　 2、得到了Pax9基因在0到7天各時(shí)期斑馬魚(yú)胚胎中的表達(dá)資料,其中Pax9基因在受精16h的斑馬魚(yú)胚胎中開(kāi)始有特異性信號(hào)出現(xiàn),還可以明顯地看到鰓弓(鰓弓,包括牙齒是由神經(jīng)嵴細(xì)胞遷徙分化而來(lái))上的特異性信號(hào)從24h-72h的遷徙和發(fā)育

10、的過(guò)程。
　　 3.得到了Pitx2基因在0到7天各時(shí)期斑馬魚(yú)胚胎中的表達(dá)資料,明顯地看到鰓弓上的特異性信號(hào)從16h-72h的遷徙和發(fā)育的過(guò)程。
　　 4.與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組(加淫羊藿苷組)中斑馬魚(yú)牙齒冠1/3和中1/3的Ca含量顯著升高,P含量顯著降低,Ca/P比值顯著升高。淫羊藿苷對(duì)斑馬魚(yú)牙齒生長(zhǎng)發(fā)育中的鈣化沉積有明顯的促進(jìn)作用。
　　 5.淫羊藿苷(0.001～0.1μg/mL)對(duì)人牙齦成纖維細(xì)胞(hum

11、angingivalfibroblasts,HGF)的增殖具有促進(jìn)作用(P＜0.01),而且呈時(shí)間依賴性,促進(jìn)HGF增殖的最佳濃度為0.01μg/mL。
　　 結(jié)論:
　　 1.進(jìn)一步明確了斑馬魚(yú)作為牙發(fā)生發(fā)育分子生物學(xué)研究模型的可行性和先進(jìn)性。從組織結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)上分析,斑馬魚(yú)牙齒和人類牙齒具有相似性,能夠作為研究牙齒發(fā)生發(fā)育的新型模式動(dòng)物。
　　 2.掌握了Pax9基因、Pitx2基因在斑馬魚(yú)牙齒發(fā)育和替換過(guò)