重組人Delta-like1蛋白的表達及其對Raji細胞作用的初步研究.pdf

1、Notch信號途徑廣泛存在于多種生物體內(nèi)，進化上高度保守，在胚胎發(fā)育、血細胞發(fā)育及腫瘤形成等多種病理生理過程中發(fā)揮重要作用。目前體外研究Notch信號對細胞增殖、分化和凋亡的作用多采用Notch配體刺激。Notch配體表達系統(tǒng)分為真核表達系統(tǒng)和原核表達系統(tǒng)。真核表達絕大多數(shù)是哺乳動物細胞系，如CHO，COS7等，但由于哺乳動物細胞表達系統(tǒng)成本高、難操作、表達水平低，限制其廣泛應(yīng)用。而原核表達系統(tǒng)由于沒有翻譯后加工修飾系統(tǒng)，表達的真核細胞

2、蛋白質(zhì)多以包涵體形式表達，復(fù)性純化方法復(fù)雜。而畢赤酵母表達系統(tǒng)兼有原核生物和真核生物的某些優(yōu)點：有翻譯后加工修飾系統(tǒng)，酵母能在簡單廉價的培養(yǎng)基中快速高密度地繁殖，產(chǎn)量高，成本低，可進行工業(yè)化生產(chǎn)。因此在選擇Notch配體的表達系統(tǒng)中我們首先選者畢赤酵母，其次是原核表達系統(tǒng)，但需要實現(xiàn)可溶性表達，以利于大規(guī)模應(yīng)用。
　　Notch信號在造血系統(tǒng)發(fā)育中起著十分重要的作用：Notch信號使共同淋巴樣祖細胞向T細胞方向分化，抑制向B細胞方

3、向的分化；在外周脾臟B細胞發(fā)育中，Notch信號激活使其向邊緣帶B細胞方向分化。此外，Notch信號的失調(diào)與血液系統(tǒng)的許多腫瘤相關(guān)，Notch信號與T細胞的惡性轉(zhuǎn)化密切相關(guān)，Notch在其中起著癌基因的作用。但Notch信號在B細胞腫瘤中的作用仍沒有定論：Notch促進B細胞腫瘤的發(fā)生，還是抑制B細胞腫瘤的生長？Notch信號在B細胞腫瘤中起著癌基因作用，還是抑癌基因？不同研究組結(jié)論不一致。
　　我們主要進行了如下幾方面的研究：<

4、br>　　1、畢赤酵母表達重組人Delta-like1（hDll1）蛋白。PCR法擴增hDll1-127-225和hDll1-26-225片段，截取已有質(zhì)粒pMikneo-Fc中Fc片段，構(gòu)建酵母表達載體pPIC9K-hDll1-127-225-Fc，pPIC9K-hDll1-26-225-Fc和pPIC9K-Fc，經(jīng)過組氨酸營養(yǎng)缺陷，G418抗生素雙重篩選陽性轉(zhuǎn)化子，甲醇誘導(dǎo)表達。
　　2、重組hDll1的原核表達。構(gòu)建原核表達

5、載體pGEX4T1-hDll1-127-225，pGEX4T1-hDll1-26-225，pET32a-hDll1-127-225和pET32a-hDll1-26-225，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，IPTG、30℃低溫誘導(dǎo)表達。
　　3、重組hDll1蛋白生物學(xué)功能的檢測。通過報告基因?qū)嶒灱皺z測Notch下游分子Hes1的表達檢測重組hDll1的生物學(xué)活性，并通過FACS及RT-PCR檢測其對Raji細胞Notch信號的激活作用。

6、r>　　4、Notch信號對Raji細胞凋亡、增殖的作用；Notch通路與BCR通路共同對Raji細胞生長的影響及其可能的分子基礎(chǔ)。重組hDll1激活Raji細胞Notch或GSI阻斷其Notch通路，以AnnexinV-PI染色、CFSE染色，通過流式細胞儀FACS研究Raji細胞凋亡、增殖。WesternBlot檢測與Raji細胞增殖密切相關(guān)c-myc的變化。
　　結(jié)論：實現(xiàn)了hDll1-26-225-Fc和人IgG1Fc片段

7、的在畢赤酵母中的表達；30℃低溫誘導(dǎo)實現(xiàn)重組hDll1（His-hDll1-127-225）的可溶性表達；通過報告基因?qū)嶒?，F(xiàn)ACS及檢測Notch下游分子Hes1的mRNA、蛋白表達驗證了重組hDll1（His-hDll1-127-225）的生物學(xué)活性；Notch激活抑制Raji細胞凋亡，促進其增殖，Notch阻斷劑GSI促進Raji細胞凋亡，抑制其增殖；Notch通路與BCR通路協(xié)同促進Raji細胞的增殖，這種協(xié)同作用能被GSI所阻