NGAL蛋白的重組表達(dá)與純化及其對(duì)食管癌細(xì)胞的體外誘導(dǎo)作用研究.pdf

1、汕頭大學(xué)博士學(xué)位論文NGAL蛋白的重組表達(dá)與純化及其對(duì)食管癌細(xì)胞的體外誘導(dǎo)作用研究姓名：張丕顯申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專(zhuān)業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師：李恩民許麗艷20090516汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院博士學(xué)位論文時(shí)，兩種食管癌細(xì)胞EC1.71和EC109的形態(tài)均發(fā)生明顯改變，主要特征是細(xì)胞收縮變小，形態(tài)變圓，同時(shí)細(xì)胞數(shù)目也減少，細(xì)胞的貼壁能力下降；而兩種食管癌細(xì)胞EC1.71和EC109相比，應(yīng)對(duì)NGAL蛋白的誘導(dǎo)作用，EC1.71似乎更敏感一些

2、，形態(tài)變化更顯著，細(xì)胞收縮更明顯。3）單丹磺酰戊二胺（Monodansylcadaverine，MDC）標(biāo)記，綠色熒光檢測(cè)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，隨著NGAL蛋白濃度逐漸由低到高，特別是當(dāng)濃度升高達(dá)到550μgml時(shí)，兩種食管癌細(xì)胞EC1.71和EC109的綠色熒光顯色均顯著變強(qiáng)，表明有明顯的細(xì)胞自噬發(fā)生。但兩種食管癌細(xì)胞EC1.71和EC109相比，在NGAL蛋白濃度相同條件下，似乎前者的綠色熒光顯色更強(qiáng)一些。這可能同樣與兩種細(xì)胞的N

3、GALR表達(dá)，以及其它相關(guān)分子的差異性本質(zhì)有關(guān)。4）在pLC3GFP融合質(zhì)粒預(yù)先轉(zhuǎn)染的基礎(chǔ)上，檢測(cè)LC3的異位分布變化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在50μgml的NGAL蛋白作用后，無(wú)論是EC1.71，還是EC109，兩種食管癌細(xì)胞均發(fā)生了明顯的LC3易位分布變化，顯現(xiàn)典型的膜性易位聚集特征，表明細(xì)胞確實(shí)發(fā)生了自噬。5）有關(guān)NGAL蛋白對(duì)食管癌細(xì)胞內(nèi)鐵離子與鐵蛋白水平影響的檢測(cè)結(jié)果表明，在本文的細(xì)胞模型實(shí)驗(yàn)條件下，外源性NGAL蛋白的作用并未引起細(xì)

4、胞內(nèi)的鐵離子濃度明顯改變，而細(xì)胞內(nèi)鐵蛋白的表達(dá)水平也未受到明顯影響。6）有關(guān)NGAL蛋白激活食管癌細(xì)胞ERK細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的檢測(cè)結(jié)果表明，50μgml的NGAL蛋白僅分別作用5min，兩種食管癌細(xì)胞均出現(xiàn)了pERK12水平的明顯升高，而且在接續(xù)下來(lái)的30min24h時(shí)間范圍內(nèi)一直保持著這種水平，而在此之前，至少NGAL蛋白作用6h，模型細(xì)胞尚未發(fā)生明顯的自噬現(xiàn)象。這表明ERK12激活是細(xì)胞自噬前的生物化學(xué)反應(yīng)事件，可能是NGAL蛋白誘

5、導(dǎo)食管癌細(xì)胞發(fā)生自噬的分子機(jī)制關(guān)鍵環(huán)節(jié)所在。7）有關(guān)NGAL蛋白激活食管癌細(xì)胞p38和JNK細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的檢測(cè)結(jié)果表明，在NGAL蛋白作用下，細(xì)胞中p38和JNK等MAPK的活性有一定的變化，但不如ERK明顯。8）有關(guān)自噬相關(guān)基因atg5、beclin1和DAPK等的轉(zhuǎn)錄情況的檢測(cè)結(jié)果表明，NGAL蛋白的作用能夠使EC1.71和EC109，在前期激活ERK12之后，進(jìn)一步導(dǎo)致atg5、beclin1和DAPK等自噬相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)。