生殖支原體P32重組蛋白的表達(dá)、純化及其對(duì)HeLa細(xì)胞的黏附作用.pdf

1、目的:構(gòu)建含生殖支原體(Mycoplasma genitalium,Mg)p32基因的重組表達(dá)載體,在大腸埃希菌(E.coli)中誘導(dǎo)表達(dá),純化表達(dá)產(chǎn)物并研究其在Mg對(duì)HeLa細(xì)胞黏附過程中的作用,以便從細(xì)胞和分子水平進(jìn)一步探索Mg對(duì)宿主細(xì)胞的黏附機(jī)制。
　　方法:相關(guān)軟件分析Mg的p32基因序列,設(shè)計(jì)特異性引物,以Mg標(biāo)準(zhǔn)株G37為模板行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增p32全長(zhǎng)843bp片段;經(jīng)雙酶切、連接反應(yīng)將p32克隆入原核表達(dá)

2、載體pET-30a(+),構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-30a(+)/P32;連入的p32基因片段經(jīng)測(cè)序鑒定正確后,人工定點(diǎn)誘變?cè)摶蛑械腡GA密碼子為TGG;將誘變后測(cè)序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入E.coli BL21(DE3),用IPTG誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE和Western blotting分析和鑒定表達(dá)結(jié)果,Ni-NTA親和層析柱純化重組蛋白,BCA法測(cè)定其濃度;將G37和純化的P32重組蛋白(rP32)分別免疫新西蘭兔,用所得相應(yīng)抗血清分

3、別行黏附試驗(yàn)和黏附抑制試驗(yàn)。
　　結(jié)果:PCR擴(kuò)增出約843bp的目的片段;構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)PCR、雙酶切和測(cè)序鑒定表明其中插入的目的片段與GenBank上登錄的G37的p32基因序列完全一致。通過 PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)誘變,p32中的TGA被成功突變?yōu)門GG。SDS-PAGE分析顯示,在IPTG誘導(dǎo)下,重組工程菌中表達(dá)了一相對(duì)分子量(Mr)約為37.6 KDa的目的蛋白,該目的蛋白在菌體細(xì)胞內(nèi)主要以包涵體形式存在,Western b

4、lotting檢測(cè)其能與G37免疫新西蘭兔所得血清發(fā)生特異性反應(yīng)。用Ni-NTA親和層析柱成功純化出該重組蛋白。黏附試驗(yàn)顯示抗rP32的多克隆抗體Pab(rP32)能用來檢測(cè)黏附于HeLa細(xì)胞表面的Mg;黏附抑制試驗(yàn)顯示Pab(rP32)可抑制Mg對(duì)HeLa細(xì)胞的黏附,并且這種抑制作用與其濃度表現(xiàn)出一定的相關(guān)性。
　　結(jié)論:
　　1、成功構(gòu)建了pET-30a(+)/P32的原核表達(dá)載體,并在E.coli中表達(dá)出Mr約為37.