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文檔簡介
1、Notch信號(hào)途徑廣泛存在于多種生物體內(nèi),且進(jìn)化上高度保守,在胚胎發(fā)育、血細(xì)胞發(fā)育及腫瘤形成等多種病理生理過程中發(fā)揮重要作用。Notch信號(hào)在造血系統(tǒng)發(fā)育中起著十分重要的作用。近來發(fā)現(xiàn),人造血干/祖細(xì)胞表面存在Notch受體的表達(dá),而在骨髓基質(zhì)細(xì)胞表面存在多種Notch配體的表達(dá),提示Notch信號(hào)途徑可能對造血干/祖細(xì)胞的自我更新與增殖起到重要作用。有研究表明Notch可以抑制造血干/祖細(xì)胞的分化,但促進(jìn)其增殖。研究還發(fā)現(xiàn),Notch
2、信號(hào)途徑能使共同淋巴樣前體細(xì)胞向T細(xì)胞方向分化,抑制向B細(xì)胞方向的分化;在外周脾臟B細(xì)胞發(fā)育中,Notch信號(hào)激活使其向邊緣帶B細(xì)胞方向分化。此外,Notch信號(hào)的失調(diào)與血液系統(tǒng)的許多腫瘤相關(guān),Notch信號(hào)與T細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化密切相關(guān),Notch在其中起著癌基因的作用。
目前體外研究Notch信號(hào)對細(xì)胞增殖、分化和凋亡的作用多采用Notch配體刺激。Notch配體表達(dá)系統(tǒng)分真核表達(dá)系統(tǒng)和原核表達(dá)系統(tǒng)。真核表達(dá)絕大多數(shù)是哺乳動(dòng)物
3、細(xì)胞系,如CHO,COS7等,但由于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)成本高、難操作、表達(dá)水平低,限制其廣泛應(yīng)用。而原核表達(dá)系統(tǒng)由于沒有翻譯后加工修飾系統(tǒng),表達(dá)的真核細(xì)胞蛋白質(zhì)多以包涵體形式表達(dá),復(fù)性純化方法復(fù)雜。而畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)兼有原核生物和真核生物的某些優(yōu)點(diǎn):有翻譯后加工修飾系統(tǒng),酵母能在簡單廉價(jià)的培養(yǎng)基中快速高密度地繁殖,產(chǎn)量高,成本低,可進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。因此在選擇Notch配體的表達(dá)系統(tǒng)中我們首先選擇畢赤酵母,其次是原核表達(dá)系統(tǒng),但需要實(shí)現(xiàn)
4、可溶性表達(dá),以利于大規(guī)模應(yīng)用。
我們主要進(jìn)行了如下幾方面的研究:
1、畢赤酵母表達(dá)重組人Delta-like1ext-Fc(hDll1ext-Fc)蛋白。PCR法擴(kuò)增hDll1ext片段,截取已有質(zhì)粒pET32a-Fc中Fc片段,構(gòu)建酵母表達(dá)載體pPIC9K-hDll1ext-Fc,和pPIC9K-Fc,經(jīng)過組氨酸營養(yǎng)缺陷,G418抗生素雙重篩選陽性轉(zhuǎn)化子,甲醇誘導(dǎo)表達(dá)。
2、重組hDll4的原核表達(dá)。構(gòu)建
5、原核表達(dá)載體pET32a-hdll4ext-26-217和pET32a-hdll4ext-93-217,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,IPTG,30℃低溫誘導(dǎo)表達(dá),鎳離子螯合珠(InvitrogenProBondTM)一步純化上清。
3、重組hDll4蛋白生物學(xué)功能的檢測。通過報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測重組hDll4蛋白的生物學(xué)活性。
結(jié)論:實(shí)現(xiàn)了hDll1ext-Fc和人IgG1Fc片段的在畢赤酵母中的表達(dá);25℃低溫誘導(dǎo)實(shí)現(xiàn)重組h
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