重組人可溶性Tim-3原核表達(dá)載體的構(gòu)建及其重組蛋白的優(yōu)化表達(dá).pdf

1、目的:
　　1、克隆人Tim-3基因胞外段序列，構(gòu)建人可溶性Tim-3（sTim-3）的重組質(zhì)粒表達(dá)載體pET28a-sTim-3-EGFP。
　　2、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，并對(duì)其表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，以獲得較多可溶性的EGFP-sTim-3融合蛋白。
　　方法:
　　按照Trizol試劑說明書(Invitrogen)取健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞提取總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑說明

2、書(Takara)構(gòu)建人Tim-3基因的cDNA文庫(kù)。根據(jù)Genebank中Tim-3序列結(jié)合跨膜預(yù)測(cè)軟件設(shè)計(jì)Tim-3胞外段上下游引物，RT-PCR擴(kuò)增Tim-3基因的胞外段片段sTim-3。產(chǎn)物與pMD18-T載體(Takara)連接轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，氨芐西林(Amp)篩選陽性克隆，進(jìn)行菌液PCR、提取質(zhì)粒雙酶切鑒定，后選取陽性克隆菌液送公司測(cè)序。對(duì)陽性菌株所提質(zhì)粒及已構(gòu)建好的原核表達(dá)載體pET28a-EGFP質(zhì)粒進(jìn)行相同

3、內(nèi)切酶雙酶切和瓊脂糖凝膠電泳回收目的DNA片段，將純化回收的sTim-3片段和EGFP-pET28a片段連接構(gòu)建pET28a-sTim-3-EGFP重組質(zhì)粒。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α進(jìn)行卡那霉素(kan)抗性篩選，挑取單菌落培養(yǎng)，經(jīng)PCR、雙酶切及測(cè)序鑒定陽性克隆。提取鑒定陽性的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)，挑取單克隆菌株培養(yǎng)進(jìn)行PCR和雙酶切驗(yàn)證。熒光顯微鏡下確定熒光較強(qiáng)的單菌落培養(yǎng)菌液行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，

4、并進(jìn)行SDS-PAGE電泳、考馬斯亮藍(lán)染色和Western blot檢測(cè)以驗(yàn)證目的蛋白。通過調(diào)整IPTG濃度、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、誘導(dǎo)溫度與誘導(dǎo)時(shí)間優(yōu)化蛋白表達(dá)條件。
　　結(jié)果:
　　1、應(yīng)用RT-PCR技術(shù)，從人外周血單個(gè)核細(xì)胞總RNA中擴(kuò)增得到約620 bp的Tim-3基因的胞外段，與載體pET28a-EGFP連接，對(duì)重組體進(jìn)行的菌液PCR、雙酶切驗(yàn)證和測(cè)序分析結(jié)果表明:成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET28a-sTim-3-EGFP。

5、
　　2、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)前后熒光顯微鏡的對(duì)比觀察顯示誘導(dǎo)后綠色熒光明顯增強(qiáng)，SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍(lán)染色以及采用His標(biāo)簽單抗和EGFP標(biāo)簽單抗進(jìn)行的Western blot檢測(cè)驗(yàn)證了約為50.0 KDa的sTim-3-EGFP融合蛋白的表達(dá)。
　　3、蛋白表達(dá)條件優(yōu)化的SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果顯示一定范圍內(nèi)的IPTG濃度對(duì)蛋白表達(dá)量沒有影響;溫