輪狀病毒非結構蛋白4的克隆、表達及其對細胞損傷作用的初步研究.pdf

1、目的：本課題構建輪狀病毒(Rotavirus，RV)非結構蛋白4(Nonstructural protein4,NSP4)及其第86～175 aa(86 to175 amino acid peptide of nonstructural protein4，NSP486-175)基因的原核表達系統(tǒng)，通過轉化E.coli BL21(DE3)、IPTG誘導表達、Ni-NTA親和層析純化等方法制備重組蛋白。分析NSP4對Caco-2細胞和原代培

2、養(yǎng)的SD大鼠神經元細胞的損傷作用，進一步探討RV對腸外細胞的損傷機制。
　　方法：
　　1.構建pET-28a(+)-NSP4和pET-28a(+)-NSP486-175表達載體膠體金法篩選A群輪狀病毒陽性糞便，提取總RNA逆轉錄為cDNA，PCR擴增出目的基因NSP4和NSP486-175，將目的基因與pMD19-T simple vector連接，轉化E.coli DH5α感受態(tài)細胞，經菌落PCR和質粒酶切鑒定后送DNA

3、測序。提取pMD19T-N SP4、pMD19T-NSP486-175和pET-28a(+)質粒分別進行雙酶切，T4DNA連接酶連接并轉化E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細胞，菌落PCR、質粒酶切鑒定及DNA測序后應用于后續(xù)試驗。
　　2.NSP4誘導表達和純化根據不同IPTG濃度和誘導時間分別對含有pET-28a(+)-NSP4和pET-28a(+)-NSP486-175的E.coli BL21(DE3)進行誘導表達，分析

4、最佳誘導條件。收集菌體沉淀，高壓破碎，SDS-PAGE分析蛋白的表達方式及表達量。破碎后的上清進行Ni-NTA親和層析純化，脫鹽柱脫鹽。取部分純化蛋白進行SDS-PAGE分析和Western blot鑒定。
　　3.RV NSP486-175蛋白對Caco-2細胞胞內游離鈣離子(intracellular free Ca2+，[Ca2+]i)干擾作用用PBS溶解重組蛋白，Bradford法檢測蛋白濃度。PBS作為陰性對照，Fluo

5、-3標記Caco-2細胞[Ca2+]i，激光共聚焦顯微鏡檢測NSP486-175對[Ca2+]i的干擾。
　　4 NSP486-175蛋白對神經元細胞的損傷作用分離培養(yǎng)出生24 h的SD大鼠神經元細胞。用不同濃度的NSP486-175刺激成熟的神經元細胞，12h后倒置顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)。收集細胞培養(yǎng)液檢測LDH活力，激光共聚焦顯微鏡觀察添加蛋白前后神經元細胞[Ca2+]i熒光強度和分布改變。
　　結果：
　　1.構建

6、pET-28a(+)-NSP4和pET-28a(+)-NSP486-175表達載體PCR產物經1％瓊脂糖凝膠電泳分析，分別在500bp和300bp左右有預期大小的條帶。pET-28a(+)-NSP4和pET-28a(+)-NSP486-175表達載體分別經NcoⅠ、XhoⅠ和NcoⅠ、HindⅢ雙酶切，目的基因均與預期大小相符。DNA測序結果與GenBank: AET43469.1序列一致。
　　2.NSP4誘導表達和純化完整的N

7、SP4在大腸埃希菌中難以表達。NSP486-175蛋白主要以可溶性方式存在，相對分子質量為10000。NSP86-175蛋白表達量在37℃，0.5mmol/L IPTG誘導7h達到高峰。SDS-PAGE分析NSP486-175蛋白主要存在于菌體破碎離心后的上清中，Ni-NTA親和層析純化用不同濃度咪唑洗脫后發(fā)現200mmol/L咪唑洗脫下來的目的蛋白最多。純化后的蛋白能與抗His多克隆抗體結合，Westernblot驗證在NC膜上相對分

8、子量10000處有特異性條帶。
　　3.RV NSP486-175蛋白對Caco-2細胞[Ca2+]i干擾作用激光共聚焦顯微鏡觀察到加入NSP486-175前后Caco-2細胞內熒光強度及熒光分布的變化。時間-平均光密度曲線顯示加入重組蛋白后平均光密度值立即升高，在24s達到峰值，之后逐漸下降，呈一過性變化未見第二峰;對照組加入PBS后無明顯變化。對照組與實驗組熒光強度變化差值的比較，t=4.507，P=0.011，差異有統(tǒng)計學意

9、義。實驗組添加NSP486-175蛋白前后熒光強度分析，t=8.211，P=0.015，差異有統(tǒng)計學意義，加蛋白后熒光強度增高。
　　4.NSP486-175蛋白對神經元細胞損傷作用原代分離培養(yǎng)的新生SD大鼠神經元細胞9d左右成熟，倒置顯微鏡下可見細胞胞體豐滿，呈不規(guī)則形或梭形，細胞突起變長增粗交錯成網絡，細胞生長狀態(tài)較好。不同濃度蛋白刺激12 h后，細胞狀態(tài)變差，細胞間隙增大，貼壁細胞減少。培養(yǎng)液中50μg/ml組與對照組比較L

10、DH活力升高，500μg/ml組LDH升高最明顯。
　　添加NSP486-175蛋白后胞內鈣離子的熒光強度和分布均有變化。時間-平均光密度曲線顯示加入重組蛋白后平均光密度值開始升高之后逐漸下降，呈一過性變化未見第二峰;對照組加入PBS后沒有明顯變化。對照組與實驗組熒光強度變化差值的比較，t=3.394，P=0.027，差異有統(tǒng)計學意義。實驗組添加NSP486-175蛋白前后熒光強度分析，t=4.362，P=0.049，差異有統(tǒng)計學

11、意義，加蛋白后熒光強度增高。
　　結論：
　　1.構建輪狀病毒完整的NSP4及其活性片段NSP486-175原核表達系統(tǒng)，對表達過程進行優(yōu)化，實現了NSP486-175蛋白的大量高效制備。
　　2.NSP486-175蛋白能夠導致Caco-2細胞內游離的Ca2+失衡，初步證實具有生物學活性，可進一步用于輪狀病毒腸外損傷機制的研究。
　　3.外源性添加NSP4后神經元細胞細胞膜完整性受到影響，LDH釋放量增高，同時